Label-free In situ Imaging de lignificação na parede celular das plantas

Summary

Um método baseado em microscopia confocal Raman é apresentado que proporciona rótulo sem visualização de lignina na parede celular das plantas e comparação de lignificação em diferentes tecidos, amostras ou espécies.

Abstract

Reunião crescentes demandas de energia de forma segura e eficiente é um desafio urgente global. Portanto, a investigação sobre a produção de biocombustíveis, que procura encontrar soluções cost-effective e sustentável tornou-se uma tarefa tópica e crítica. Biomassa lignocelulósica é posicionado para se tornar a principal fonte de biomassa para a conversão em biocombustíveis líquidos ^1-6. No entanto, a recalcitrância desses materiais da parede celular de plantas para a degradação do custo-efetiva e eficiente apresenta um grande impedimento para a sua utilização na produção de biocombustíveis e produtos químicos ^4. Em particular, a lignina, complexo e irregular heteropolímero poli-fenilpropanóides, torna-se problemática para a pós-colheita desconstrução da biomassa lignocelulósica. Por exemplo, na conversão de biomassa para os biocombustíveis, inibe sacarificação dos processos destinados a produção de açúcares simples para fermentação ^7. O uso efetivo de biomassa vegetal para fins industriais é de fato em grande parte dependente da medida em que a parede celular vegetal é lignificado. A remoção de lignina é um fator limitante caro e ⁸ e lignina, portanto, tornar-se um melhoramento de plantas chave e alvo da engenharia genética, a fim de melhorar a conversão da parede celular.

Ferramentas analíticas que permitem a caracterização exata rápida lignificação da parede celular das plantas cada vez mais importante para avaliar um grande número de populações reprodutoras. Procedimentos extrativistas para o isolamento de componentes nativos, como a lignina são inevitavelmente destrutivas, trazendo química significativa e modificações estruturais ^9-11. Química analítica nos métodos in situ são, portanto, ferramentas inestimáveis ​​para a caracterização composicional e estrutural de materiais lignocelulósicos. Microscopia Raman é uma técnica que depende de espalhamento inelástico ou Raman de luz monocromática, como a de um laser, onde a mudança na energia dos fótons do laser está relacionado às vibrações moleculares e apresenta uma intrínseca label-free "impressão digital" molecular da amostra . Microscopia Raman pode pagar medições não-destrutivas e relativamente barato com a preparação da amostra mínima, dando insights sobre composição química e estrutura molecular em uma situação próxima do estado nativo. Química de imagens por microscopia confocal Raman tem sido utilizado anteriormente para a visualização da distribuição espacial de celulose e lignina nas paredes celulares de madeira ^12-14. Com base nesses resultados anteriores, temos recentemente adoptado este método para comparar lignificação no tipo selvagem e lignina deficiente transgênicos trichocarpa Populus (preto cottonwood) haste de madeira ^15. Analisando as bandas Raman ^16,17 lignina na região espectral entre 1600 e 1700 cm ^-1, intensidade de sinal de lignina e localização foram mapeados in situ. Nossa abordagem visualizadas diferenças no conteúdo de lignina, localização e composição química. Mais recentemente, demonstramos imagem Raman de polímeros da parede celular em Arabidopsis thaliana com resolução lateral que é sub-M ^18. Aqui, este método é apresentado proporcionando a visualização de lignina na parede celular das plantas e comparação de lignificação em diferentes tecidos, amostras ou espécie, sem manchas ou rotulagem dos tecidos.

Protocol

1. Preparação da Amostra

1. Monte a amostra vegetal hidratado, por exemplo, madeira de álamo-tronco ou caule Arabidopsis thaliana, no micrótomo.
2. Cortar secções finas (normalmente 20 mm de espessura) do tecido original.
3. Transferência da seção de plantas para uma lâmina de vidro.
4. Mergulhe a seção planta em D ₂ O e cobrir com uma lamínula de vidro, que é selado a lâmina de microscópio para evitar a evaporação de D ₂ O. A seção de plantas já está pronto para imagens ou pode ser armazenado para uso futuro.

2. Medição da amostra

1. Aplicar óleo de imersão para a objetiva do microscópio e / ou a lamínula.
2. Lugar e garantir a lâmina de microscópio no palco scan piezoelétrico do microscópio, com a lamínula de frente para a objetiva do microscópio.
3. Ver a amostra através do lamínula usando uma alta abertura numérica objetiva do microscópio de imersão (100x, NA = 1,40) e localizar a área da amostra de interesse.
4. Depois de desligar todas as outras fontes de luz e microscópio de laboratório, a posição-resolvido microspectroscopic medições são realizadas focando bandpass filtrada luz monocromática verde (λ = 532 nm) de uma cw-laser sobre a amostra com um poder típico de 10 a 30 mW ( veja a Figura 1 para um esquema do setup). Autofluorescência pode ocorrer em algumas amostras, que pode proibir medições úteis, em que a excitação caso com mais luz de comprimento de onda do laser pode ser aconselhável.
5. O back-luz difusa Stokes-shifted Raman é coletado pela objetiva do microscópio, passa por um espelho dicróico, uma pinhole, que serve como um filtro espacial na configuração confocal, e um filtro longpass, e está focada na fenda de uma grade espectrômetro, onde a luz é espectralmente dispersa e detectada por uma câmera CCD refrigerado, dando um espectro Raman. Um espectro Raman de madeira de álamo é mostrado na Figura 2, com bandas de lignina característica na região espectral entre 1600 e 1700 cm ^-1.
6. Para imagens de química e visualização da distribuição espacial de lignina, um mapa bidimensional espectral é adquirida pela digitalização raster a amostra através do foco do laser com a fase de digitalização e gravação piezoelétrico um espectro Raman para cada posição da amostra. Mapas tridimensionais espectrais podem ser geradas pelo empilhamento de mapas bidimensionais em que o foco do laser foi reforçada consecutivamente ao longo da direção z.

3. Análise de Dados

1. Para a indústria química e visualização de imagens de lignina, os dados coletados são analisados ​​usando MATLAB (MathWorks, versão 7.7). Os dados são organizados em um cubo tridimensional hiperespectrais, que é composto pelas duas dimensões espaciais e uma terceira dimensão para os sinais espectrais.
2. Para a análise de lignina, a região espectral entre 1550 e 1700 cm ^-1 é considerado (ver Figura 2). A distribuição espacial da lignina é visualizado através da integração da intensidade de 1.550 a 1.700 cm ^-1 dos espectros de linha de base corrigida (ver Figura 3). Como uma alternativa para correção de linha de base, da derivada segunda espectros podem ser computados e os picos de segunda derivativos utilizados para análise.
3. Lignina localização e química, especialmente com relação a coniferaldehyde e metades de álcool coniferil, podem ser analisados ​​através da avaliação da área sob os picos equipado Gaussian das três bandas encontrados entre 1.600 e 1.700 cm ^-1 (ver inserção da Figura 2 e 15 Refs. - 17).
4. Normalização intensidade entre diferentes mapas espectral é realizada utilizando como referência a altura do pico da banda OD extrínsecos alongamento cerca de 2.500 cm ^-1 nos espectros da luz média, que são obtidos por meio de classificação k-clustering. Isto é crítico e permite comparar as intensidades de sinal de lignina entre as medidas diferentes, tecidos, amostras e espécies.

4. Resultados representante

Um espectro Raman representativo de madeira de álamo haste (Populus angustifolia) é mostrado na Figura 2. Lignina bandas características são encontradas na região espectral entre 1600 e 1700 cm ^-1. Como exemplo, a distribuição espacial da lignina em uma madeira de álamo seção transversal é apresentada na Figura 3. Em comparação com a imagem visível, regiões morfologicamente distintas parede celular se claramente distinguíveis devido às diferentes intensidades de lignina sinal. Alto sinal de lignina é observado nos cantos das células (CC) e, um pouco menos, no meio composto lamelas (CML). Quantidades inferiores, ainda não insubstancial, de lignina são observados dentro da camada S2 da parede das fibras. Variabilidade de lignina intensidade do sinal é encontrado em certa medida, dentro de CC, CML e S2, especialmente da fibra a fibra. A resolução lateral espacial em nossas medições é de aproximadamente 300 nm. A qualidade dos dados presta-se bem para comparar entre lignificaçãoamostras e para continuar a dissecar lignina química ^15.

Figura 1: Um esquema da configuração instrumental BP:. Bandpass filtro; DM: espelho dicróico, PH: pinhole; LP: longpass filtro.

Figura 2: Um espectro Raman representativo de madeira de álamo haste (Populus angustifolia) registrados em D ₂ O. A área realçada espectral (ver também o inset) marca a região espectral tendo três picos especificamente atribuíveis a lignina.

Figura 3: Raman imagem lignina (inferior) de uma madeira de álamo seção transversal (de cima: imagem visível), obtida pela integração da intensidade do sinal Raman de 1.550 a 1.700 cm ^-1.

Discussion

Materiais lignocelulósicos são hierárquicas e heterogêneo em relação à estrutura e composição. Ferramentas para uma aprofundada caracterização analítica que têm sensibilidade química, resolução espacial, e que dão insights sobre estas matérias no contexto nativas são desejáveis. O método descrito permite a visualização de lignina e comparação de lignificação da biomassa vegetal lignocelulósica com resolução espacial que é sub-M, sem manchas ou rotulagem das amostras em uma situação próxima do estado nativo. Ela exige a preparação da amostra mínima e as medições são não-destrutivo e relativamente barato. O método pode ser útil na avaliação lignificação associado a um grande número de populações reprodutoras. Além de lignina, os espectros Raman também contêm impressões espectrais de celulose e hemicelulose a, que podem ser incluídos em uma análise abrangente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
microscope slides
cover slips
D2O
nail polish
immersion oil
tweezers
pointed brush
microtome
confocal Raman microscope