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Biology

라벨 - 무료 현장에서 이미징

Published: November 1, 2010 doi: 10.3791/2064
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2
1Energy Biosciences Institute, University of California, Berkeley, 2Molecular Foundry, Lawrence Berkeley National Laboratory, 3Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

Summary

공촛점 래맨 현미경에 따라 방법은 레이블이없는 식물 세포 벽에 리그닌의 시각화 및 다른 조직, 표본 또는 수종의 lignification의 비교를 내실수 것을 제공됩니다.

Abstract

회의 성장 에너지를 안전하게 요구하고 효율적으로 눌러 글로벌 도전입니다. 따라서, 비용 효과적이고 지속 가능한 해결책을 찾기 위해 추구하고 바이오 연료 생산에 대한 연구는 시사하고 중요한 작업이되고있다. 리그노셀룰로오스성 바이오 매스는 액체 바이오 연료 1-6로 변환을 위해 바이오 매스의 주요 원천이 될 태세이다. 그러나, 비용 효과적이고 효율 저하 이러한 식물 세포 벽 재료의 말을 안들음는 바이오 연료와 화학 물질 4의 생산에서 사용하기위한 주요 장애를 제공합니다. 특히, 리그닌, 복잡하고 불규칙적인 쓰임새 phenylpropanoid heteropolymer는 리그노셀룰로오스성 바이오 매스의 postharvest 해체에 문제가된다. 바이오 연료를위한 바이오 매스 전환 예를 들어, 발효 7 간단한 설탕 생산하기위한 프로세스에서 당화을 억제. 산업 목적으로 식물 바이오 매스의 효과적인 사용은 식물 세포 벽이 lignified되는 범위에 크게 의존 사실이다. 리그닌의 제거 비용과 제한 요인 8 리그닌 따라서 세포 벽 변환을 개선하기 위해 주요 식물 육종 및 유전 공학의 대상이 될 가지고있다.

식물 세포 벽의 lignification의 정확한 빠른 특성을 허용 분석 도구는 사육 인구의 다수를 평가하기위한 점점 중요한된다. 같은 리그닌과 같은 ​​기본 구성 요소의 분리를위한 추출 절차는 크게 화학 및 구조 변경에 대해 9-11 데리고, 불가피하게 파괴하고 있습니다. 원위치 방법으로 분석 화학 따라서 리그노셀룰로오스성 물질의 구성 및 구조 특성에 대한 소중한 도구입니다. 래맨 현미경은 레이저 광자의 에너지에 변화가 분자 진동과 관련되는 레이저에서 그런식으로, 단색 광의 탄력이나 래맨 산란에 의존하고 시료의 고유 라벨 무료 분자 "지문"을 제시하는 기술입니다 . 래맨 현미경 원래 상태로 가까이에있는 화학 성분과 분자 구조에 대한 통찰력을주는 최소한의 샘플 준비 비 파괴적이고 비교적 저렴​​한 측정을 여유가 있습니다. 공촛점 래맨 현미경으로 화학 이미징는 이전에 다음 ID로 셀룰로오스와 나무 세포 벽 12-14에서 리그닌의 공간적 분포의 시각화에 사용되고 있습니다. 이러한 이전 결과를 바탕으로, 우리는 최근 야생 유형 및 리그닌 - 결함 유전자 변형 포풀러스 trichocarpa (블랙 커튼 우드) 줄기 나무 15 lignification을 비교하는이 방법을 채택했습니다. 1600 및 1,700cm -1, 리그닌 신호 강도와 현지화 사이의 스펙트럼 영역에서 리그닌 래맨 밴드에게 16,17 분석은 현장에 매핑되었습니다. 우리의 접근 방식은 리그닌 함량의 차이, 지역화, 그리고 화학 성분을 시각. 최근, 우리는 18 하위 μm의 해상도는 가로 Arabidopsis thaliana의 세포 벽 고분자의 래맨 이미지를 보여주었다. 여기,이 방법은 얼룩이나 조직의 상표없이 식물 세포 벽에 리그닌의 시각화 및 다른 조직, 표본 또는 수종의 lignification의 비교를 affording 제공됩니다.

Protocol

1. 샘플 준비

  1. 마이크로톰에 수산화 식물 표본, 예를 들어 포플러 나무의 줄기 또는 Arabidopsis thaliana의 줄기를 탑재합니다.
  2. 기본 조직의 얇은 부분을 (일반적으로 20 μm의 두께) 그만둬.
  3. 유리 현미경 슬라이드에 공장 섹션을 전송합니다.
  4. D 2 O의 공장 섹션을 만끽하고 D 2 O.의 증발을 방지하기 위해 현미경 슬라이드에 밀폐되어 유리 커버 슬립과 커버 공장 부분은 이제 이미지 준비 또는 그것은 나중에 사용하기 위해 저장할 수 있습니다.

2. 샘플 측정

  1. 현미경 목표 및 / 또는 커버 슬립에 침지 기름을 적용합니다.
  2. 장소 및 현미경 목표가 직면하고있는 커버 슬립과 현미경의 압전 스캔 단계에서 현미경 슬라이드를 확보.
  3. 높은 수치 조리개 침지 현미경 목표를 사용하여 커버 슬립 (100x, NA = 1.40)를 통해 샘플을보고 관심 샘플 영역을 찾습니다.
  4. 다른 모든 실험실과 현미경 광원을 전환 후, 위치 - 해결 microspectroscopic 측정이 10-30 MW의 전형적인 전원 (과 샘플에 CW - 레이저에서 밴드 - 필터링 단색 녹색 빛을 (λ = 532 nm의) 초점을 맞춤으로써 수행됩니다 ) 설치의 구조에 대한 그림 1을 참조하십시오. Autofluorescence 오래 파장 레이저 빛이 케이스 여기는 것이 좋습니다 수있는 유용한 측정을 금지할 수있는 몇 가지 샘플에 발생할 수 있습니다.
  5. 백 흩어져 스톡 - 이동 래맨 빛이 현미경의 목적에 의해 수집, 공촛점 설정에서 공간적 필터 역할을하는 이색성 거울, 핀홀, 그리고 longpass 필터를 통해 전달하고, 격자의 슬릿에 중점을두고 있습니다 빛이 spectrally 분산 및 래맨 스펙트럼을 제공, 냉각 CCD 카메라에 의해 감지 분광계. 포플러 나무 래맨 스펙트럼은 1600과 1천7백센티미터 -1 사이의 스펙트럼 영역의 특성 리그닌 밴드, 그림 2에 표시됩니다.
  6. 공간 리그닌 분포의 화학 이미징 및 시각화 들어, 2 차원 스펙트럼지도 래스터는 압전 스캔 무대와 레이저 초점을 통해 샘플을 검사하고 각 샘플의 위치에 대한 래맨 스펙트럼을 기록하여 인수합니다. 입체 스펙트럼지도 레이저 초점이 Z - 방향을 따라 연속적으로 강화되었다있는 2 차원지도를 스태킹에 의해 생성된 수 있습니다.

3. 데이터 분석

  1. 화학 이미징 및 리그닌 시각화 경우, 수집된 데이터가 MATLAB를 (MathWorks, 버전 7.7)를 사용하여 분석합니다. 데이터는 두 공간 크기와 스펙트럼 신호를위한 3 차원으로 구성되어 있습니다 3 차원 hyperspectral 큐브에 배치됩니다.
  2. 리그닌의 분석을 위해, 1550 및 1,700cm -1 사이의 스펙트럼 영역은 (그림 2 참조)으로 간주됩니다. 리그닌의 공간적 분포 1550에서 기준 - 수정 스펙트럼 (그림 3 참조) -1 1,700cm에 강도를 통합하여 시각입니다. 기본 수정의 대안으로, 두 번째 유도체 스펙트럼 계산하고 두 번째 파생 봉우리는 분석을 위해 사용될 수 있습니다.
  3. . 특히 coniferaldehyde 및 coniferyl 알코올 moieties에 관한 리그닌 현지화 및 화학은, 더 (그림 2 및 심판 15 삽입된 페이지보고 1600 및 1천7백cm -1 사이의 발견 세 밴드의 장착할 가우스 봉우리 아래에있는 영역을 평가하여 분석 수 있습니다 - 17).
  4. 다른 분광지도 사이의 강도 정규화는 참조 클러스터링 분류 K는 -을 통해 얻을 수있는 평균 루멘 스펙트럼에서 2500 cm -1 주위에 불순물 OD 스트레칭 밴드의 최고 높이로 사용하여 수행됩니다. 이것은 중요 한가 다른 측정, 티슈, 샘플과 종 사이에 리그닌 신호 강도를 비교할 수 있습니다.

4. 대표 결과

포플러 (포풀러스 angustifolia) 줄기 나무 대표 래맨 스펙트럼은 그림 2에 표시됩니다. 특색 리그닌 밴드는 1600과 1,700cm -1 사이의 스펙트럼 영역에서 찾을 수 있습니다. 예를 들어, 포플러 나무 단면에서 리그닌의 공간적 분포는 그림 3에 표시됩니다. 보이는 이미지에 비해, morphologically 별개의 세포 벽 지역 인해 다른 리그닌 신호 강도에 명확히 구별할됩니다. 높은 리그닌 신호 강도는 복합 중간 lamellae (CML)에, 다소 적은, 세포 코너 (CC)에 준수하고 있습니다. 리그닌의 낮은, 아직 실질이없는없는 금액은 섬유의 S2 벽 계층 내에서 관찰됩니다. 리그닌 신호 강도의 변화는 특히 섬유로 섬유, CC, CML과 S2 사이 어느 정도 발견된다. 우리가 측정의 측면 공간 해상도가 ~ 300 NM입니다. 데이터 품질 사이 lignification을 비교 잘라는 것으로추가 리그닌 화학 15 해부하다하는 샘플합니다.

그림 1
그림 1 : 기계 설치의 구조 BP :. 대역 통과 필터, DM : 이색성 거울, PH : 핀홀, LP : longpass 필터.

그림 2
그림 2 : D 2 O에 기록된 포플러 (포풀러스 angustifolia) 줄기 나무 대표 래맨 스펙트럼. 강조 분광 영역 (또한 삽입된 페이지 참조) 리그닌 세 봉우리가 구체적으로 귀책 가진 스펙트럼 영역을 표시합니다.

그림 3
그림 3 : 1550에 1천7백cm -1에서 래맨 ​​신호 강도를 통합하여 얻은, : 포플러 나무 단면의 래맨 리그닌 이미지 (아래) (보이는 이미지 상단).

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Discussion

리그노셀룰로오스성 자료는 계층적 구조 및 구성 모두에 관한 이기종입니다. 화학 감도, 공간 해상도, 그것을 깊이 특성 분석 도구에 대한 기본 컨텍스트에서 해당 콘텐츠를 통찰력 바람직한된다주세요. 설명한 방법은 리그닌, 자연 상태로 가까이에 얼룩이나 샘플의 라벨없이 하위 μm의 공간입니다 해상도 리그노셀룰로오스성 식물 바이오 매스의 lignification 비교의 시각을 내실수가 있었죠. 그것은 최소한의 샘플 준비가 필요하며 측정이 아닌 파괴와 비교적 저렴​​합니다. 방법은 사육 인구의 다수와 관련된 lignification을 평가에 유용할 수 있습니다. 리그닌 이외에 래맨 스펙트럼은 또한 포괄적인 분석에 포함될 수있는 스펙트럼 셀룰로오스의 지문과 hemicelluloses을 포함합니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

우리는 결실 협력하고 도움 토론 앤드류 캐롤, 밝은 Chaibang, Purbasha 사카르 (에너지 Biosciences 연구소, 버클리), 바람 파빈 (로렌스 버클리 국립 연구소)와 빈센트 L. 치앙 (노스캐롤라이나 주립 대학)을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 에너지 Biosciences 연구소에 의해 지원되었다. 분자 파운드리에서 근무가 계약 번호 DE - AC02 - 05CH1123에 따라 에너지의 미국학과의 과학 오피스, 기본 에너지 과학 사무소에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
microscope slides
cover slips
D2O
nail polish
immersion oil
tweezers
pointed brush
microtome
confocal Raman microscope

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References

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식물 생물학 제 45 래맨 현미경 리그닌 포플러 나무 Arabidopsis thaliana
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Schmidt, M., Perera, P.,… More

Schmidt, M., Perera, P., Schwartzberg, A. M., Adams, P. D., Schuck, P. J. Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls. J. Vis. Exp. (45), e2064, doi:10.3791/2064 (2010).

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