Summary
Langendorff मोड के साथ संयोजन के रूप में पृथक दिल छिड़काव,
Abstract
Bioengineered माउस मॉडल शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण आणविक परिवर्तन और मॉडल के बीच हृदय रोग के कारण रिश्तों के निर्धारण में बन गए हैं. हालांकि आणविक जीव विज्ञान संकेतन मार्ग में महत्वपूर्ण परिवर्तनों की पहचान करने में आवश्यक है, यह कार्यात्मक महत्व के लिए एक किराए की नहीं है. जबकि फिजियोलॉजी समारोह के प्रश्न के उत्तर प्रदान बरकरार में चयापचयों का जैव रासायनिक आकलन के साथ शरीर क्रिया विज्ञान के संयोजन कर सकते हैं, दिल की धड़कन हृदय समारोह और energetics की एक पूरी तस्वीर के लिए अनुमति देता है. सालों के लिए, हमारी प्रयोगशाला पृथक दिल perfusions परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर) के साथ संयुक्त इस कार्य को पूरा उपयोग किया गया है. वाम ventricular समारोह Langendorff मोड पृथक दिल perfusions द्वारा मूल्यांकन किया है जबकि हृदय energetics प्रदर्शन द्वारा मापा जाता है
Protocol
- इन प्रयोगों के लिए, एक साथ दो अलग अलग प्रणालियों का उपयोग कर रहे हैं. 31 पी स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण के लिए एक Bruker 14T चुंबक अवांस III सांत्वना और topspin v2.1 सॉफ्टवेयर के साथ लैस कंप्यूटर के साथ interfaced है. हृदय समारोह के मूल्यांकन के लिए, एक कस्टम निर्मित दिल छिड़काव प्रणाली PowerLab 4 / 30 डाटा अधिग्रहण, डेटा विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर के साथ 6 LabChartPro सुसज्जित के साथ interfaced है.
- 0.5mm EDTA, 5.3mM KCl, 1.2mm MgSO 4, 118mM NaCl, और 25mm NaHCO 3: प्रयोग के दिन, 1 लीटर क्रेब्स Henseleit बफर के निम्नानुसार तैयार है. मिश्रण तो 5% सीओ 2 / 95% 2 हे 2mm CaCl 2 के अलावा से पहले 10-15 मिनट के लिए के साथ bubbled है. अंत में, substrates, 10 मिमी ग्लूकोज और 0.5mm पाइरूवेट के रूप में जोड़ा कर रहे हैं.
- प्रयोग के दौरान तापमान विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है. गरम circulators 37.0 के बीच तापमान बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाता है - 37.5 डिग्री सेल्सियस जबकि दिल चुंबक अंदर है. तापमान एक फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच का उपयोग करके प्रयोग की अवधि के लिए नजर रखी है.
- छिड़काव दबाव और छोड़ दिया ventricular दबाव एक डाटा अधिग्रहण प्रणाली से जुड़ी है और शामिल सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शित दबाव transducers के माध्यम से निगरानी कर रहे हैं. ये एक मानक रक्तदाबमापी के साथ प्रयोग करने के लिए पहले कैलिब्रेटेड हैं. इसके अलावा, दबाव लाइनों पर्याप्त रूप से प्लावित कर रहे हैं क्रम में करने के लिए सभी हवाई बुलबुले को दूर.
- 150 मिमी सोडियम फास्फेट (जो के.एच. बफर के ईओण ताकत के बराबर है) के एक मानक नमूना जांच हृदय की प्रविष्टि पहले "जांचना" प्रयोग किया जाता है. इस संकेत की सुविधा और अधिग्रहण अवधि शुरू एक बार दिल की जांच के भीतर तैनात है के लिए आवश्यक समय कम हो जाती है.
- जमावट को कम करने के लिए, माउस हेपरिन आईपी के 5 मिनट के बाद 200 इकाइयों, सोडियम pentobarbital आईपी (175 मिलीग्राम / किग्रा) दिया जाता है इंजेक्शन के साथ है.
- दिल तेजी से फेफड़ों और thymus बरकरार () के साथ excised है और बर्फ का ठंडा के.एच. बफर में गिरफ्तार.
- जबकि बर्फ पर रखा है, फेफड़ों जल्दी से हटा रहे हैं. thymus की lobes और पहचान कर रहे हैं और धीरे से उसकी पीठ खुली महाधमनी बेनकाब. thymus हटा दिया है. महाधमनी तो ध्यान से किसी भी आसपास के ऊतकों को हटाने के द्वारा अलग है.
- माइक्रो suturing संदंश धीरे महाधमनी के दोनों दीवारों पकड़ लुमेन बेनकाब करने के लिए उपयोग किया जाता है. महाधमनी 0.965 मिमी आयुध डिपो पॉलीथीन टयूबिंग (PE50) से बना प्रवेशनी पर ध्यान रखा गया है. महाधमनी एक माइक्रो पोत क्लैंप के साथ जगह में आयोजित किया जाता है जबकि sutures जल्दी महाधमनी के आसपास बंधे हैं. क्लिप निकाल दिया है और संदंश सावधानी से जाँच करें कि प्रवेशनी महाधमनी जड़ से ऊपर है उपयोग किया जाता है. अतिरिक्त संबंधों के लिए जगह में दिल पकड़ आवश्यक के रूप में जोड़ रहे हैं.
- कोई अतिरिक्त ऊतक संदंश और microscissors का उपयोग करने के लिए हटा दिया है. एक छोटा सा चीरा बाईं कर्ण - शष्कुल्ली में बनाया है. एक .61 मिमी आयुध डिपो पॉलीथीन टयूबिंग (PE10) ध्यान से बाएं आलिंद, एल.वी. गुहा, सुप्रीम माध्यम और बाहर के माध्यम से डाला जाता है, जबकि धीरे दिल पकड़े. अतिरिक्त टयूबिंग की छंटनी की है.
- एक पिचकाकर पानी से भरे गुब्बारे atrium के माध्यम से एल.वी. में डाला जाता है और चिपकने वाला टेप या sutures का उपयोग जगह में आयोजित है. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप की गति धीरे - धीरे दिल को पर्याप्त प्रवाह प्रदान करने के लिए बढ़ जाती है. जब तक दिल एनएमआर जांच में जगह है, दिल निरंतर प्रवाह के साथ लगभग 2 मिलीग्राम / मिनट के बराबर perfused होना जारी रहेगा. एल.वी. गुब्बारा एक micrometer सिरिंज का उपयोग करने के लिए सत्यापित करें कि एल.वी. दबाव transducer कार्य कर रहा है एक छोटी सी मात्रा के साथ फुलाया जाता है.
- दिल ध्यान से एक 10 मिमी एनएमआर ट्यूब में डाला जाता है. एक व्यापक बोर "स्पिनर" में मदद करने के लिए जांच के भीतर उचित स्थिति में ट्यूब गाइड करने के लिए प्रयोग किया जाता है. पूरे तंत्र को तो मजबूती से चिपकने वाला टेप के साथ "गर्भनाल" से जुड़ी है.
- गर्भनाल धीरे चुंबक के ऊपरी बोर में उतारा है जब तक ट्यूब / दिल एनएमआर 10 मिमी एनएमआर जांच के कुंडल अंदर है.
- एक बार दिल की जांच के भीतर उचित स्थिति में है, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप प्रवाह के क्रम में 80mmHg के छिड़काव दबाव को प्राप्त करने के लिए निकाला जाता है. (याद रखें, कि इस बिंदु पर लगभग 2 मिलीग्राम / मिनट की एक निरंतर प्रवाह के साथ perfused दिल था). छिड़काव दबाव तो पंप नियंत्रक पर "पकड़" तंत्र को सक्रिय करने के द्वारा बनाए रखा है. दिल तो एक 15-20 मिनट संतुलन अवधि की अनुमति दी है. उस समय के दौरान, एल.वी. गुब्बारे की मात्रा 8-10 mmHg के अंत diastolic दबाव को प्राप्त करने के लिए निकाला जाता है.
- संतुलन अवधि के दौरान, यह स्पेक्ट्रोमीटर मापदंडों का अनुकूलन क्रम में सबसे अच्छा संभव फॉस्फोरस संकेत प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. इस आवृत्ति, जिस पर फॉस्फोरस नाभिक प्रतिध्वनित ("ट्यूनिंग") में रेडियो पल्स सेटिंग और चुंबकीय क्षेत्र समरूप बनाने ("shimming") के द्वारा पूरा किया है.
- संतुलन अवधि के बाद, एकाधिक 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रा प्राप्त किया जा सकता है . प्रत्येक स्पेक्ट्रम के लिए अधिग्रहण की अवधि टी पर निर्भर हैवह क्षेत्र चुंबक की शक्ति, नमूने का आकार, और शोर एक विशिष्ट प्रयोग के लिए आवश्यक अनुपात करने के लिए संकेत. स्पेक्ट्रा 14 Telsa चुंबक का उपयोग कर एक 60 डिग्री फ्लिप कोण और 2.0 सेकंड में देरी के साथ 20 μs 256 रेडियो आवृत्ति दालों से प्राप्त संकेत के औसत से प्राप्त कर रहे हैं. यह प्रयोग लगभग 10 मिनट की आवश्यकता होगी.
प्रतिनिधि परिणाम
डाटा अधिग्रहण हार्डवेयर और LabChart सॉफ्टवेयर से, हृदय समारोह के कई मानकों को प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल भर में मापा जा सकता है. हृदय समारोह के विशिष्ट उपाय, बाएं निलय विकसित दबाव (LVDevP), systolic दबाव (चित्रा 1) से अंत diastolic दबाव (EDP) का subtracting द्वारा प्राप्त की है. इस उपाय माउस का तनाव और दिल की हालत (यानी, दबाव अधिभार) के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. हालांकि, एक सामान्य C57BL6 माउस दिल LVDevP में 8-10 mmHg के तय अंत diastolic दबाव में 100-110 mmHg के बीच आम तौर पर है. इसके अलावा, LabChart कार्यक्रम एल.वी. दबाव तरंगों के चक्रीय माप के आधार पर दिल की दर की माप के लिए अनुमति देता है. फिर, इस उपाय भिन्न कर सकते हैं लेकिन ठेठ मूल्यों 350-400 bpm जब दिलों आंतरिक दरों पर हरा करने के लिए अनुमति दी जाती है. हालांकि, हृदय मानकीकृत पेसिंग प्रणाली जहां हृदय की दर 420 bpm में रखा जाता है का उपयोग कर सकते हैं. इसके अलावा, (+ डी पी / dt) सिकुड़ना और विश्राम (-dP/dt) के उपायों एल.वी. दबाव की लहर के पहले व्युत्पन्न का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है. प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के दौरान यह दबाव मात्रा एक रिश्ता शामिल द्वारा स्टार्लिंग तंत्र का आकलन करने के लिए आसान है. यह एल.वी. गुब्बारा मात्रा में क्रमिक वृद्धि कर रही है और के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ईडीपी LVDevP टिप्पण द्वारा पूरा किया है. ये मान तो प्लॉट के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया जा सकता है. जबकि स्टार्लिंग वक्र इष्टतम है, टिप्पण 8-10 mmHg के ईडीपी प्राप्त करने के लिए आवश्यक मात्रा एल.वी. कक्ष आयाम के एक अप्रत्यक्ष विचार दे सकते हैं. इस hypertrophied दिल के रूप में बैंडिंग महाधमनी के मॉडल में इस्तेमाल किया जा सकता है आमतौर पर एक छोटे गुब्बारे मात्रा की आवश्यकता होती है जबकि फैली हुई दिल एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है जब नियंत्रण की तुलना में में. तालिका 1 प्रतिनिधि हृदय समारोह के रूप में छिड़काव प्रोटोकॉल के दौरान अर्जित डेटा प्रदर्शित करता है.
31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर phosphocreatine (पीसीआर) के संकेत और एटीपी (γ-एटीपी, α-एटीपी, और β-एटीपी) के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है अकार्बनिक फॉस्फेट (Pi) से तीन फॉस्फेट प्रदान करेगा. इन चोटियों के प्रत्येक के विश्लेषण वक्र के तहत क्षेत्र के लिए एक मूल्य प्रदान करता है. γ-एटीपी और β-एटीपी क्षेत्रों औसत से एटीपी की राशि का अनुमान है. (Α-एटीपी क्योंकि NAD अणुओं कुल संकेत के एक अनजान भाग में योगदान नहीं प्रयोग किया जाता है). दिल की ऊर्जावान स्थिति पीसीआर और एटीपी क्षेत्रों (एटीपी अनुपात: पीसीआर) के भागफल के द्वारा निर्धारित किया जाता है. यह मान आम तौर पर 1.5 - एक माउस प्राथमिक सब्सट्रेट के रूप में ग्लूकोज के साथ आपूर्ति की दिल में 1.7. हालांकि 31 पी एनएमआर एटीपी या पीसीआर के प्रत्यक्ष उपाय प्रदान नहीं करता है, चोटियों के क्षेत्र नमूने में फास्फोरस युक्त यौगिकों की राशि के लिए आनुपातिक है . इन संकेतों के लिए मान के अन्य तरीकों का उपयोग करके अनुमान लगाया जा सकता है. उदाहरण के लिए, दिल के एक काउहोट में उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) द्वारा एटीपी के प्रत्यक्ष उपायों औसतन एकाग्रता उपज कर सकते हैं. यह मान तो औसत एटीपी स्पेक्ट्रा में मनाया क्षेत्रों जांचना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पीसीआर एकाग्रता एटीपी क्षेत्र के लिए पीसीआर रिश्तेदार क्षेत्र के आधार पर गणना की जा सकती है. अकार्बनिक फॉस्फेट के रिश्तेदार रासायनिक बदलाव (Pi) पीसीआर संकेत के लिए संकेत का विश्लेषण करके पीएच अनुमान यह भी संभव है एक अलग रेडियो पल्स दृश्यों, creatine kinase प्रतिक्रिया वेग या एटीपी संश्लेषण प्रतिक्रिया वेग का प्रयोग भी. मापा जा सकता है 2
तालिका 1. पृथक perfused दिल से आधारभूत हृदय समारोह. बाएं निलय विकसित दबाव; LVEDP: LVDevP बाएं निलय अंत - diastolic दबाव, मानव संसाधन: हृदय की दर, आरपीपी: दर दबाव उत्पाद, + डी पी / dt: पहली व्युत्पन्न एल.वी. दबाव सकारात्मक; -dP/dt: पहली व्युत्पन्न एल.वी. दबाव नकारात्मक, पीपी छिड़काव दबाव, सीएफ़: कोरोनरी प्रवाह.
चित्रा 1. LabChart प्रो सॉफ्टवेयर से प्रतिनिधि एल.वी. दबाव तरंगों.
चित्रा 2 प्रतिनिधि नियंत्रण (ठोस लाइन) और महाधमनी (डॉटेड लाइन) बंधी चूहों से स्टार्लिंग घटता. ए) सिस्टोलिक समारोह के रूप में बढ़ती एल.वी. मात्रा अधिक LVDevP द्वारा प्रतिनिधित्व के रूप में एल.वी. गुब्बारे की मात्रा द्वारा निर्धारित है. बी) Diastolic समारोह के रूप में बढ़ती एल.वी. मात्रा अधिक ईडीपी द्वारा प्रतिनिधित्व के रूप में एल.वी. गुब्बारे की मात्रा द्वारा निर्धारित है. बाएं निलय विकसित दबाव (सिस्टोलिक शून्य डायस्टोलिक पी: LVDevP) ressure, ईडीपी: अंत - diastolic दबाव.
चित्रा 3. प्रतिनिधि पृथक perfused माउस दिल के 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रा. अपेक्षाकृत छोटे Pi चोटी पर ध्यान दें. ग्लूकोज के अलावा पाइरूवेट या फैटी एसिड के साथ एक aerobically perfused आपूर्ति दिल में, इस शिखर कम किया जाना चाहिए. Ischemia की अवधि के दौरान, इस शिखर बढ़ जाती है जबकि पीसीआर चोटी घट जाती है. Α-एटीपी चोटी के दाएँ कंधे सूचना. इस NAD अणुओं का योगदान है. पीसीआर, अकार्बनिक फॉस्फेट:: Pi phosphocreatine, एटीपी: adenosine triphosphate.
Discussion
31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी Langendorff perfused पृथक माउस दिल में विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्रदान करता है 3. 4, हालांकि, यह जरूरी है कि महाधमनी और एल.वी. गुब्बारे की प्रविष्टि का cannulation ठीक से ऐसे कर रहे हैं स्थिर हृदय प्रदर्शन की अनुमति है जबकि एनएमआर अंदर ट्यूब. इसके अलावा, तापमान विनियमन सर्वोपरि है क्रम में करने के लिए समुचित आधारभूत समारोह को प्राप्त करने. अच्छा, analyzable एनएमआर स्पेक्ट्रा प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कारक शोर अनुपात करने के लिए संकेत बढ़ती जा रही है. यह सुनिश्चित करने के इष्टतम "ट्यूनिंग" और नमूना पर "shimming" द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. प्रोटोकॉल पाठ में उल्लेख किया है, एक मानक नमूना पूर्व दिल की प्रविष्टि का उपयोग इस सुविधा कर सकते हैं. यह भी उपयोगी है एक पर्याप्त आकार "नमूना" है. कम से कम 100 मिलीग्राम वजन दिल आमतौर पर कम पीसीआर और एटीपी संकेतों तो अधिग्रहण के समय में बढ़ जाती है अच्छा फॉस्फोरस स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो जाएगा प्रदान करते हैं.
मौजूदा प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए अतिरिक्त हृदय समारोह और energetics के बारे में जानकारी जुटाने के लिए कई तरीके हैं. हमारी प्रयोगशाला में, हम मिश्रित सब्सट्रेट buffers है जो फैटी एसिड के विभिन्न संयोजनों (निम्न और उच्च सांद्रता में) लैक्टेट, ketones, और इंसुलिन की उपस्थिति शामिल कर सकते हैं के साथ दिल perfused है. छिड़काव बफर में स्थिर आइसोटोप का उपयोग (यानी, 13 सी substrates लेबल) के साथ, हम लेबल acetyl सीओए के रिश्तेदार TCA चक्र के लिए अपने योगदान के द्वारा सब्सट्रेट उपयोग का अनुमान करने की क्षमता के अधिकारी इस आवेदन के लिए 5-7 ., हम isotopomer प्रदर्शन 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ 13-C3 और ग्लूटामेट 13-C4 का विश्लेषण . यह जरूरी छिड़काव प्रोटोकॉल के अंत में दिल फ्रीज clamping और जमे हुए ऊतक के एक निष्कर्षण प्रदर्शन. यह एक अतिरिक्त प्रयोग के रूप में विश्लेषण अलग सेटअप मानकों के साथ एक अलग जांच के उपयोग की आवश्यकता हो जाएगा. अन्य अनुप्रयोगों बफर में deoxyglucose साथ ग्लूकोज के प्रतिस्थापन शामिल है, जबकि 2-31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर दिल में फॉस्फेट deoxyglucose के समय पर निर्भर संचय की निगरानी है. इस विधि दौरे ग्लूकोज तेज की माप के लिए अनुमति देता है 7, 8 इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला कार्डियक समारोह और छिड़काव ischemia / reperfusion और उच्च कार्यभार चुनौती का मिलकर प्रोटोकॉल में energetics विश्लेषण किया गया है. 6 , 8-10.
सारांश में, 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी पृथक माउस दिलों में एक तकनीकी चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया के अत्याधुनिक उपकरणों का उपयोग की आवश्यकता है. हालांकि, डेटा है कि यह पैदावार शोधकर्ता, जो समारोह और bioengineered माउस मॉडल की energetics का विश्लेषण करना चाहते हैं के लिए अमूल्य है. हमारी प्रयोगशाला के लिए, इन तकनीकों हृदय समारोह, energetics, और चयापचय पर तनाव की एक किस्म के परिणामों की हमारी समझ में महत्वपूर्ण गया है 1, 11 12 .
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए उसके समर्थन के लिए एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी भाग के दौरान प्रयोग के Lynne स्पेंसर का शुक्रिया अदा करना होगा. यह काम स्वास्थ्य निधि R01 HL059246 के राष्ट्रीय संस्थानों, HL067970 R01, R01 (डॉ. Tian) HL088634 और HL096284 F32 (डा. Kolwicz) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Magnesium Sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| EDTA | Reagent | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Potassium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | P4505 | |
| Sodium bicarbonate | Reagent | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Calcium chloride dihydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| D-Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Sodium Pyruvate | Reagent | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Bruker Ultrashield 600WB Plus | Equipment | Bruker Corporation | ||
| PowerLab 4/30 | Equipment |  ADInstruments |
ML866/P | |
| LabChart 6 Pro | Equipment | ADInstruments |
MLS260/6 | |
| Quad Bridge Amp | Equipment | ADInstruments |
ML224 | |
| STH Pump Controller | Equipment | ADInstruments |
ML175 | |
| Minipuls 3 Peristaltic Pump | Equipment | ADInstruments |
ML172 | |
| Disposable BP Transducer | Equipment | ADInstruments |
MLT0699 | |
| 10mm NMR Sample Tube | Equipment | Wilmad LabGlass | 513-7PP-7 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Equipment | BD Biosciences | 427401 | |
| Physiological Pressure Transducer | Equipment | ADInstruments |
MLT844 | |
| Polyethylene tubing PE50 | Equipment | BD Biosciences | 427411 | |
| Micrometer syringe | Equipment | Gilmont Instruments | GS-1101 | |
| McPherson Forceps | Equipment | Miltex Inc. | 18-949 | |
| Castraviejo microscissors | Equipment | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5650 | |
| Neoptix Signal Conditioner | Equipment | Neoptix, Inc. | Reflex - 1 |
References
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