Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

Summary

Transgene Würmer werden häufig in Verwendung

Abstract

Die Anzahl der Laboratorien, die die frei lebenden Nematoden C. elegans wächst rasant. Die Popularität dieser biologischen Modell ist eine schnelle Erzeugung und kurze Lebensdauer, einfache und kostengünstige Wartung, vollständig sequenzierten Genoms und Array von RNAi Ressourcen und mutierten Tieren zugeschrieben. Zusätzlich Analyse der C. elegans Genoms ergab eine große Ähnlichkeit zwischen Würmern und höheren Wirbeltieren, die die Forschung in Würmer könnten eine wichtige Ergänzung zu Studien in ganze Mäuse oder kultivierten Zellen durchgeführt werden, schlägt. Ein leistungsfähiger und wichtiger Bestandteil der Wurm Forschung ist die Fähigkeit, transgene Tiere zu verwenden, um Gen-Lokalisation und Funktion zu untersuchen. Transgene Tiere können entweder über Mikroinjektion der Wurm Keimbahn oder durch den Einsatz von biolistischen Bombardement erstellt werden. Bombardment ist eine neuere Technik und weniger vertraut ist, eine Reihe von Laboren. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll, um transgene Würmer biolistischen Beschuss mit Goldpartikeln mit dem Bio-Rad PDS-1000-System zu generieren. Im Vergleich mit DNA-Mikroinjektion in Hermaphrodit Keimbahn, hat dieses Protokoll den Vorteil, dass keine besonderen Fähigkeiten des Betreibers im Hinblick auf die Identifizierung Wurm Anatomie oder die Durchführung Mikroinjektion. Weitere mehreren transgenen Linien sind in der Regel aus einer einzigen Bombardierung erhalten. Ebenfalls im Gegensatz zu Mikroinjektion, produziert biolistischen Bombardement transgene Tiere mit sowohl extrachromosomale Arrays und integrierte Transgene. Die Fähigkeit, integrierte transgenen Linien zu erhalten kann die Verwendung von mutagenen Protokolle Fremd-DNA zu integrieren. Zusammenfassend kann biolistischen Bombardement eine attraktive Methode für die Erzeugung von transgenen Tieren, vor allem für die Ermittler nicht in der Anlage der Zeit und den Aufwand, sich geschickt in Mikroinjektion interessiert.

Protocol

Überblick

Traditionell transgenen Würmer wurden durch Mikroinjektion transgene DNA in die C erzeugt elegans Keimbahn ^1,2,3,4. Während erfolgreich, benötigt dieser Ansatz spezialisierte Ausrüstung und der Entwicklung von Erfahrungen mit Wurm Anatomie und Mikroinjektionstechnik. In jüngerer Zeit biolistischen Bombardement als ein alternativer Ansatz, die DNA-beschichtete Goldpartikel verwendet, um Fremd-DNA in die Keimbahn ^5,6 einführen entwickelt worden. Dieser Ansatz erfordert weniger Zeit Investitionen in Bezug auf die Praxis erfolgreich zu werden.

Die biolistischen Bombardierung von C. elegans, um transgene Würmer erzeugen eine geringe Effizienz auf der Ebene der einzelnen Wurm so Erfolg erfordert eine große Menge von Tieren. Diese können auf verschiedene Arten angebaut werden, aber wir verwenden Ei Platten, die Arbeit und die Anzahl der Platten zu reduzieren. Unser Protokoll beginnt mit der Herstellung von Eiprodukten Platten und Würmer und konzentriert sich dann auf die Bombardierung Protokoll unter Verwendung des Bio-Rad PDS-1000/He Hepta System. Wir angepasst unserem Protokoll zum Teil von der Arbeit der Berezikov et al ^7.

Mit Bombardements ist die unc-119-Gen in der Regel als ein Marker für transgene Tiere eingesetzt. Worm Stämme, die diese Mutation sind stark unkoordiniert und kaum bewegen können, sind in Aussehen pummelig, und sind unfähig, dauer Larven ^{8 zu} bilden. Die Dauer ist eine alternative Larvenstadium, die zur Entwicklung einer reproduktiven erwachsenen Verzögerung unter widrigen Umständen ist, und der Einstieg in dauer wird durch mehrere Gene ⁹ geregelt. Mehrere Stämme, die das unc-119-Gens aus dem C. verfügbar elegans Genetics Center (CGC, Minneapolis, MN). Die ursprüngliche DP38 Stamm (unc-119 (ed3)) führt auch eine unabhängige dauer-Bildung konstitutiv (daf-c)-Mutation, die stromabwärts Experimente beeinträchtigen könnten. Mehrere Labors haben diese Mutation outcrossed und HT1593-Stamm ist von der CGC. Wir finden, dass transgene Tiere sind etwas leichter zu identifizieren mit dem DP38-Stamm und neigen dazu, diesen Stamm für die Schaffung transgener Tiere zu verwenden. Wenn nötig, verwenden wir HT1593 zu den transgenen Würmern outcross die daf-c-Mutation zu entfernen. Getting die DP38 Würmern zu wachsen ist eine der langsamsten Schritte in das Protokoll, so dass wir einen Bestand von wachsenden Platten zu halten, während der Vorbereitung der Transgene.

Expression des unc-119-Marker zusammen mit dem Gen von Interesse ermöglicht eine einfache Kennzeichnung der Tiere zum Ausdruck des Transgens auf Rettung der normalen Beweglichkeit und Körpergröße ⁵ basierend. Die unc-119-Gen kann aus mehreren Quellen, und Vektoren mit dem unc-119 genomische DNA, unc-119-Promotors und cDNA und die genomische DNA für die kleineren C erhalten werden briggsiae Gen ^8,10 verwendet. Wir berichteten kürzlich über ein einfaches Protokoll, um einen UNC-119 Kassette keine Plasmid eine Ampicillin-Resistenz-Gen durch homologe Rekombination ¹¹ und eine Methode zur Wurm Fosmide ändern, um die unc-119-Gens durch Cre-lox Rekombination führen zu generieren transgenen Tieren ^{12 merken.} Die Plasmide werden aus Addgene Inc. (Cambridge, MA) zur Verfügung.

Während der Aufwand bei der Durchführung einer einzigen Bombardierung beteiligt ist erheblich, aber tragbar, ist die zusätzliche Arbeit bei der Durchführung mehrerer Bombenangriffe an einem einzigen Tag beteiligt minimal. Folglich haben wir routinemäßig Cluster der Produktion von transgenen Würmer, die Arbeit bei der Erzeugung jeder einzelnen beteiligten verringern.

1. Egg Platte Vorbereitung

Die unc-119 mutierten Würmer sind schwer zu Standard NGM-Platten, weil mit ihrer gehbehinderten sie neigen dazu, auf Teile einer Platte verhungern, während andere Teile der Platte enthalten noch Nahrung anzubauen. Egg-Platten dieses Problem zu lösen, wie die dicke Schicht auf Lebensmittel Ei Platten ermöglicht unc-119 Würmer leichter kriechen und über die ganze Platte ⁷ zu nehmen. Das Ei Platten haben auch den Vorteil der Unterstützung des Wachstums von einer großen Anzahl von Würmern so weniger Platten ¹³ erforderlich sind. In der Regel 5 Eier Platten sind ausreichend, um Würmer für eine Bombardierung zu wachsen. Das folgende Rezept macht etwa 50 Platten können aber halbiert, um weniger, wenn gewünscht.

Das Ei Platten können sich leicht verschmutzt, so dass wir beide Antibiotika und Antimykotika Verwendung in den Platten und verwenden Sie nur Eier von Hypochlorit-Behandlung für die Aussaat der Platten erzeugt.

Tag 1:

1. Bereiten LB (400 ml) in einer 500ml Flasche. Autoklaven für 20min.
2. Gießen ~ 50 10 cm NGA-Platten mit 1 Liter NGA mit 2% Agar. Wir fügen Nystatin 10 mL pro Liter und Streptomycin zu 200 pg / mL ^13.
3. Wachsen ein 40 ml Übernachtkultur von OP50-1 in LB mit 200 pg / ml Streptomycin. Diese Sorte ist resistent gegen Streptomycin und erhältlich bei CGC.
4. Autoclave einer 500ml Flasche füram nächsten Tag.

Tag 2:

1. Separate Eigelb von 10 Hühnereiern in die sterile Flasche. Wir verwenden ein Eigelb-Separator (erhältlich bei Haushalts-Stores, darunter Target). Shake.
2. Bringt Volumen 400mL mit LB. Schütteln
3. Inkubation bei 60 ° C für 1 Stunde.
4. Auf Raumtemperatur abkühlen.
5. Fügen Sie 40ml OP50-1. Schütteln
6. Verteilen Sie 5-8 ml der Mischung pro Platte.
7. Lassen Platten über Nacht bei Raumtemperatur zu regeln.

Tag 3:

1. Vorsichtig abgießen restliche Flüssigkeit aus Platten. Lassen Sie sich mit Deckeln auf dem Trockenen über Nacht bei Raumtemperatur.

Tag 4:

1. Put-Platten in einem Karton oder Plastikbeutel und lagern bei 4 ° C bis zum Gebrauch. Diese Platten zu sein scheinen OK für 1-2 Monate verwenden.

2. Seeding Egg-Platten

1. Erweitern Sie die DP38 Würmer auf 6 cm NGA Platten durch Zugabe von konzentrierter OP50 bis vor kurzem verhungert Platten. Für einen einzigen Bombardierung, verwenden wir ~ 6 kleine Teller, Saatgut 5 Eier Platten. Bei mehreren Bombardements, verwenden wir die kleinen Platten, anstatt Samen 2 angereichert Pepton Platten vor der Aussaat das Ei Platten.
2. Isolieren Sie Eier aus dem DP38 Würmer über die Verwendung von Hypochlorit ^13,14. Resuspendieren die Eier in sterile S-basale oder M9-Puffer ^13,14.
3. Fügen Sie die Eier (> 10.000 pro Platte), um die entsprechende Anzahl von Ei-Platten. Wachsen die Würmer auf Ei-Platten bei 20 ° C für 7-10 Tage bis zur Bombardierung verwenden. Die Platten werden sofort einsatzbereit, sobald die Würmer damit begonnen haben, die Nahrung von den Platten zu löschen. Diese Platten sind wirklich schwer zu hungern und immer für längere Laufzeiten wird Wurm Ausbeute zu verbessern.

Beschuss

Wir bereiten die Goldaktien vor der Zeit und halten Sie sie bei 4 ° C für den Einsatz gespeichert. Auch benötigt werden unbefleckt und gefleckt 10 cm NGA-Platten. Die unbefleckt Platten müssen im Voraus gegossen werden und gut trocknen, um die Absorption der Flüssigkeit mit den Würmern aufgenommen zu erleichtern.

Am Tag des Bombardements, waschen wir aus den Würmern zuerst, dann beginnen die Vorbereitung der DNA-beschichtete Goldpartikel. Wir fügen Sie dann die Würmer, die unbefleckt NGA Platten und Finish Waschen der Goldpartikel und ihre Übertragung auf die macrocarriers.

Gold-Partikel der Zubereitung:

1. Wiegen 60mg von Goldpartikeln in einem 1,7 ml Röhrchen und genießen in 70% Ethanol für 15min. Spin kurz zur Fällung der Goldpartikel.
2. 3 x waschen in sterilem Wasser und Spin jedes Mal kurz, um das Gold zu sammeln.
3. Resuspendieren Gold in 1 ml 50% sterilem Glyzerin. Dies ist das Lager Goldpartikel Lösung und kann über Monate bei 4 ° C gelagert werden

Worms:

1. Float der DP38 Würmer aus dem Ei-Platten mit S-Basal-oder M9-Puffer und Übertragung auf einen 50 mL konischen Rohr.
2. Halten Sie die Rohre auf der Bank, bis die Würmer im Boden sind. Dann saugen Sie den Puffer und fügen neue S-Basal-oder M9. Wash 2 oder 3 mal, bis Puffer relativ frei von Schmutz. Halten Sie die Würmer auf diesen Schritt, bis die DNA-Beschichtung ist abgeschlossen.
3. Saugen Sie und lassen Sie ca. 2-3 ml von Würmern in Puffer pro Bombardement. Transfer in ein 10 cm unbefleckt NGA Platte auf Eis. Es ist wichtig, Minimierung des übertragenen Volumens als NGA Platte muss vollständig trocknen, bevor Beschuss. Achten Sie darauf, die gesamte Oberfläche der Platte mit den Würmern zu decken.
4. Lassen Platte auf Eis trocken. Das Eis wird die Würmer aus Verklumpung beim Trocknen zu verhindern.

Dieser Schritt ist wichtig: die Platte sollte trocken sein und die Würmer gleichmäßig verteilt auf der NGA Platte. Keeping the Würmer auf Eis verhindert, dass sie Bewegung auf der Platte und Aggregation in Stapel.

DNA-Präparation (für ein Bombardement):

1. Mix in einem 1,7 ml Tube:
   • 50 ul Goldpartikel. Resuspendieren gründlich, bevor Sie.
   • 50 ul DNA (10-15ug). Wir sehen kaum einen Unterschied zwischen kreisförmigen oder linearen DNA. Normalerweise verwenden wir Qiagen Midiprep Patronen für DNA-Aufreinigung (Qiagen Inc., Valencia, CA).
   • 50 ul 2,5 M CaCl _2. Diese Lösung wird für mehrere Wochen bei Raumtemperatur stabil.
   • 20 &mgr; l 0,1 M Spermidin.
     
     Die Spermidin ist instabil in wässriger Lösung. Wir machen 70μl Aliquots Spermidin und bei -20 ° C. Wir fügen Sie dann 1ml Wasser direkt vor verwenden, um eine 0,1 M Lösung zu erhalten. Diese Lösung muss bereit sein für jedes Bombardement frisch.
     
     Wir in der Regel Wirbel die Goldpartikel in einem 1,7 ml Röhrchen mit einer niedrigen Geschwindigkeit und fügen Sie dann die CaCl _2, DNA und Spermidin / Protamin tropfenweise unter Vortexen. Für die Menschen, die mit Kalziumphosphat transfiziert haben diese Technik vertraut ist.
     
     Wir haben auch Protamin verwendet anstelle von Spermidin mit sehr guten Ergebnissen ^15. Wir bereiten eine neue Lösung (1mg/ml) in Wasser und unse 50 ul statt der 20 &mgr; l von Spermidin. Wenn wir Protamin verwenden wir in der Regel inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für 10 Minuten statt der Platzierung auf dem Eis. Protamin muss nicht eingefroren werden und ist ein Pulver, statt einer Flüssigkeit.
2. Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 30 Minuten, und in regelmäßigen Abständen mischen, um die Gold-Partikel in der Schwebe zu halten. Dann kurz Spin und saugen Sie den Überstand.
3. Waschen mit 300μl 70% Ethanol. Spin kurz.
4. Waschen mit 1 ml 100% Ethanol. Spin kurz.
5. Resuspendieren in 170μl 100% Ethanol.

Vorbereitung der macrocarriers:

1. Spülen 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) in 2-Propanol. Setzen Sie sie auf Seidenpapier und lassen Sie sie bei Raumtemperatur trocknen.
2. Add 20 &mgr; l des DNA / Gold-Mischung in der Mitte eines jeden Macrocarriers. Achten Sie darauf, Wirbel rechts vor dem Pipettieren, um das Gold in der Schwebe zu halten.
3. Lassen Sie das Ethanol verdampfen.

3. Beschuss

Achten Sie darauf, einen leeren Bombardements durchzuführen, bevor das Experiment zu Helium durch das System zu spülen.

1. Schalten Sie Vakuumpumpe und schließen Vakuumpumpe Falle. Wir verwenden eine ölfreie Vakuumpumpe.
2. Schalten Sie Heliumtank. Überprüfen Sie, dass der Druck ≥ 2200psi.
3. Wet Berstscheibe (1350 psi) in 2-Propanol, indem in Haltekappe für Hepta-Adapter.
4. Schraubadapter in PDS-1000-System, und ziehen Sie mit dem mitgelieferten Drehmomentschlüssel.
5. Legen Sie die 7 macrocarriers in die Halterung und Sitz sie mit dem mitgelieferten Tool. Dann eine hepta Stop-Bildschirm und unten auf den Inhaber. Klappen Sie den Halter über Ort und auf dem zweiten Regal von oben. Das Gold entdeckt Seite des macrocarriers muss unten an dieser Stelle.
6. Richten Sie die Löcher in der Spitze der Macrocarriers Halter mit den Ausgängen des Hepta-Adapter.
7. Setzen Sie den NGA-Platte mit Würmern (Deckel) auf der untersten Regal im Bombardement Kammer beschichtet.
8. Völlig offen das Vakuum Durchfluss-Knopf auf der PDS-1000. Presse vac-Taste, bis Kammer erreicht 26 In Hg. Dann Schalter auf Position, um das Vakuum zu halten halten.
9. Drücken und halten Sie den Feuerknopf, bis die Scheibe reißt. Dies wird geschehen, wenn der Druck erreicht 1350psi. Manchmal dauert 5-20 Sekunden auftreten. Lassen Sie die Taste.
10. Release-Vakuum Kammer (vent-Position), und entfernen Platte.
11. Schalten Vakuum und Helium aus.
12. Feuer mehrere Male, bis die Zeile nicht enthält Helium (Helium-Meßgerät sollte 0 psi-Zeichen).
13. Schalten Sie den PDS-1000-System.

Worm Erholung nach der Bombardierung:

1. Verlassen Sie die bombardiert Platte bei 20 ° C für 20 Minuten.
2. Float die Würmer von der Platte mit 10 ml S-Basal-oder M9-Puffer.
3. Legen Sie 0,5 ml Würmer auf 20 bis 10 cm gesichtet NGA-Platten.
4. Lassen Sie bei 20 ° C oder bei Raumtemperatur (22-24 ° C) für ca. 2 Wochen vor dem Einchecken für gerettete Würmer.
5. Bildschirm für Würmer mit dem unc-119 (+)-Phänotyp mit einem Binokular. Der optimale Zeitpunkt für das Screening ist nach dem Platten verhungert, da die Rettung Würmer Überlebensvorteil gegenüber nicht gerettet Würmer haben.
6. Generieren Sie eine einzelne Zeile aus jeweils 10 cm Platte, die gerettet Würmer enthalten.

4. Repräsentative Ergebnisse

Der Erfolg des Protokolls im Hinblick auf den Erhalt transgenen Tieren hängt von der jeweiligen Transgens. Für Promoter: GFP-Reporter Transgene haben wir bis zu 20 Zeilen erhalten. Ein typisches Ergebnis ist 3-10 Zeilen. Bis zu 30% der transgenen Linien integriert sind Linien, aber dies ist zufällig, und wir werden mehrere Bombardements an einem einzigen Tag durchführen, wenn eine integrierte Linie besonders erwünscht ist.

Discussion

Biolistic Bombardement ist eine einfache Methode, um Fremd-DNA in vielen Organismen einzuführen, einschließlich C. elegans ^1,5,6,7,16. Es stützt sich auf Goldpartikel Bildung eines Komplexes mit DNA in Gegenwart von CaCl _2. Kationische Polyamine wie Spermidin, schützen DNA aus Nucleaseabbau in vivo. Da Spermidin ist ein instabiles Molekül, ist es wichtig, sie in kleinen Portionen bei -20 ° C, und nehmen Sie die Lösung direkt vor der Durchführung des Bombardements. Wie wir in der Bombardierung Protokoll beschrieben, kann Protamin statt Spermidin verwendet werden, um fremde DNA zu liefern ^15. Protamin hat den Vorteil, dass mehr bei Raumtemperatur stabil und wird ein Pulver anstelle einer viskosen Flüssigkeit.

Die unc-119 Rettungs-Gen kann entweder in cis gelegt werden auf dem gleichen Plasmid wie das Transgen oder auf einem separaten Plasmid, das mit dem Transgen vermischt wird vor der Beschichtung der Goldpartikel. Während das Mischen von einem oder mehreren Plasmiden ist in der Regel erfolgreich ist, haben wir und andere festgestellt, dass Bombardierung von Würmern mit mehreren Plasmiden können transgene Tiere tragen einige schaffen, aber nicht alle Plasmide ^6,11. Zur Erleichterung der Platzierung der unc-119-Gen auf dem Transgen-Plasmid, haben wir kürzlich beschrieben ein Protokoll über homologe Rekombination dem unc-119-Gen in die Ampicillin-Resistenz-Gen in fast allen Plasmiden ¹¹ Legen.

Weitere, auf bewegte Transgenen aus dem DP38 Stamm in Wurm-Stämmen fehlt das unc-119-Mutation zu erleichtern, haben wir auch erzeugt ein Plasmid mit unc-119 fusioniert mCherry ^11. Die pan-neuronalen mCherry Fluoreszenz kann dann verwendet werden, um die Anwesenheit des Transgens in einer Vielzahl von genetischen Hintergründen ¹¹ Track werden.

Einige Transgene dürfte schwierig sein, nach der Bombardierung durch schwache Expression oder eine Bühne besonderen Ausdruck zu erkennen. Die Anwesenheit des Transgens kann oft durch den Einsatz von PCR unter Verwendung der transgenen Würmer überprüft werden. Für Transgene mit schwacher Expression kann eine zusätzliche Bombardements auf die Identifizierung von Linien mit stärkeren Ausdruck zu führen. Alternativ kann die Verwendung einer Verbindung oder konfokalen Mikroskop oft mit der Visualisierung der Ausdruck von fluoreszierenden Proteinen zu helfen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold particles	Inbio gold	BD021	1micron
Midiprep kit	Qiagen	12143
Spermidine	Sigma-Aldrich	S4139
Protamine	Sigma-Aldrich	P4505
Macrocarriers	Bio-Rad	165-2335
PDS-1000/He Hepta System	Bio-Rad	165-2257
Rupture disk	Bio-Rad	165-2330
Nystatin	Sigma-Aldrich	N1638
Streptomycin	MP Biomedicals	100556