Generatie van transgene C. elegans Door biolistische Transformatie

Summary

Transgene wormen worden vaak gebruikt in

Abstract

Het aantal laboratoria met behulp van de vrij levende nematode C. elegans groeit snel. De populariteit van deze biologische model wordt toegeschreven aan een snelle generatietijd en korte levensduur, makkelijk en goedkoop onderhoud, volledig gesequenced genoom, en het aanbod van RNAi middelen en mutant dieren. Bovendien, de analyse van de C. elegans genoom onthulde een grote overeenkomst tussen wormen en hogere gewervelde dieren, wat suggereert dat het onderzoek in wormen kunnen een belangrijke aanvulling op studies uitgevoerd geheel muizen of gekweekte cellen. Een krachtig en belangrijk onderdeel van worm onderzoek is de mogelijkheid om transgene dieren te gebruiken om gen-lokalisatie en functie te bestuderen. Transgene dieren kunnen worden gemaakt ofwel via micro-injectie van de worm kiembaan of door het gebruik van biolistische bombardement. Bombardement is een nieuwere techniek en is minder bekend een aantal laboratoria. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol om transgene wormen genereren door biolistische bombardement met gouddeeltjes met behulp van de Bio-Rad PDS-1000-systeem. In vergelijking met DNA micro-injectie in de hermafrodiet kiembaan, dit protocol is het voordeel dat er geen speciale vaardigheden van de operator met betrekking tot het identificeren van worm anatomie of het uitvoeren van micro-injectie. Verdere meerdere transgene lijnen worden meestal verkregen uit een bombardement. Ook in tegenstelling tot micro-injectie, biolistische bombardement produceert transgene dieren met zowel extrachromosomaal arrays en geïntegreerde transgenen. De mogelijkheid om geïntegreerde transgene lijnen te krijgen kan voorkomen dat het gebruik van mutagene protocollen aan buitenlandse DNA integreren. Concluderend kan biolistische bombardement een aantrekkelijke methode voor het genereren van transgene dieren, met name voor de onderzoekers niet geïnteresseerd in het investeren van de tijd en inspanning die nodig is om te worden bedreven in het micro-injectie.

Protocol

Overzicht

Traditioneel transgene wormen werden gegenereerd door microinjecting transgen DNA in de C. elegans kiembaan ^1,2,3,4. Hoewel succesvol, deze aanpak vereist gespecialiseerde apparatuur en de ontwikkeling van ervaring met worm anatomie en de micro-injectie techniek. Meer recent biolistische bombardement is ontwikkeld als een alternatieve benadering die DNA-gecoate gouddeeltjes gebruikt om vreemd DNA te introduceren in de geslachtscellen ^5,6. Deze aanpak vergt minder tijdsinvestering in termen van de praktijk om succesvol te worden.

De biolistische bombardement van C. elegans om transgene wormen genereren heeft een lage efficiëntie op het niveau van de individuele worm, zodat succes vereist een grote hoeveelheid dieren. Deze kunnen worden gekweekt op verschillende manieren, maar we gebruiken ei platen om het werk en het aantal betrokken platen te verminderen. Ons protocol begint met de voorbereiding van de ei-platen en wormen en vervolgens richt zich op het bombardement protocol met behulp van de Bio-Rad PDS-1000/He Hepta System. We passen ons protocol in een deel van het werk van de Berezikov et al. ^7.

Met bombardement, is de unc-119-gen doorgaans gebruikt als een marker voor transgene dieren. Worm stammen dragen deze mutatie zijn sterk ongecoördineerd en nauwelijks bewegen, zijn Dumpy in verschijning, en zijn niet in staat om Dauer larven ⁸ te vormen. Het Dauer is een alternatieve larvale stadium die wordt gebruikt om de ontwikkeling vertraging van een reproductieve volwassen onder ongunstige omstandigheden, en de inwerkingtreding van Dauer wordt geregeld door meerdere genen ^9. Verschillende stammen het dragen van de unc-119-gen zijn verkrijgbaar bij de C. elegans Genetics Center (CGC, Minneapolis, MN). De oorspronkelijke DP38 stam (unc-119 (ED3)) draagt ​​ook een onafhankelijke Dauer-formatie constitutieve (daf-c) mutatie die van invloed kunnen stroomafwaarts experimenten. Een aantal laboratoria hebben outcross deze mutatie, en de HT1593 stam is verkrijgbaar bij de CGC. We vinden dat transgene dieren wat gemakkelijker te identificeren met de DP38-stam en hebben de neiging om deze stam te gebruiken voor het creëren van transgene dieren. Indien nodig maken we gebruik van HT1593 om de transgene wormen te kruisen met de DAF-c mutatie te verwijderen. Aan de DP38 wormen om te groeien is een van de traagste stappen in het protocol, dus houden we een voorraad van groeiende platen, terwijl de voorbereiding van de transgenen.

Expressie van de UNC-119 marker, samen met het gen van interesse maakt een eenvoudige identificatie van de dieren de uiting van de transgen gebaseerd op redding van de normale beweeglijkheid en de lichaamsgrootte ^5. De UNC-119 gen kan worden verkregen uit verschillende bronnen, en vectoren met behulp van de unc-119 genomisch DNA, unc-119 promotor en cDNA, en de genomische DNA voor de kleinere C. briggsiae gen worden gebruikt ^8,10. We hebben onlangs beschreef een eenvoudig protocol om een unc-119 cassette toe te voegen aan een plasmide dat een ampicilline resistentie-gen door homologe recombinatie ¹¹ en een methode om worm fosmids wijzigen om de unc-119 gen dragen door Cre-lox recombinatie voor het genereren van transgene dieren ^12. De plasmiden zijn verkrijgbaar bij Addgene Inc (Cambridge, MA).

Terwijl de inspanning die betrokken zijn bij het uitvoeren van een enkele bombardement is aanzienlijk, maar beheersbaar, de extra werkzaamheden in verband met het uitvoeren van meerdere bombardementen op een enkele dag is minimaal. Daarom zijn wij regelmatig cluster voor de productie van transgene wormen aan het werk betrokken zijn bij het genereren van iedere daling.

1. Ei Plate Voorbereiding

De UNC-119 mutant wormen zijn moeilijk te op de standaard NGM platen te groeien, want met hun verminderde mobiliteit hebben ze de neiging om te verhongeren op delen van een plaat, terwijl andere delen van de plaat bevatten nog steeds eten. Ei platen op te lossen dit probleem op als de dikke laag op voedsel ei platen maakt unc-119 wormen gemakkelijker kruipen en over te nemen al de plaat ^7. Het ei platen hebben ook het voordeel van ondersteuning van de groei van een groot aantal wormen, zodat er minder platen nodig zijn ^13. Meestal 5 ei borden voldoende zijn om wormen te kweken voor een bombardement. Het onderstaande recept maakt ongeveer 50 platen, maar kan worden gehalveerd om minder indien gewenst.

Het ei platen kunnen gemakkelijk besmet raken, zodat we zowel de antibiotica en antimycotica gebruik in de platen en alleen gebruik maken van eieren die door hypochloriet behandeling voor het zaaien van de platen.

Dag 1:

1. Bereid LB (400 ml) in een 500ml fles. Autoclaaf voor 20min.
2. Giet ~ 50 10 cm NGA platen met behulp van 1 liter NGA met 2% agar. We voegen nystatine 10 ml per liter en streptomycine tot 200 ug / ml ^13.
3. Grow een 40 ml 's nachts de cultuur van de OP50-1 in LB met 200 ug / ml streptomycine. Deze soort is bestand tegen streptomycine en beschikbaar bij CGC.
4. Autoclaaf een 500ml fles voorvolgende dag.

Dag 2:

1. Afzonderlijke dooiers van 10 kippeneieren in de steriele fles. We maken gebruik van een dooier separator (verkrijgbaar bij winkels voor huishoudelijke artikelen, waaronder Target). Shake.
2. Breng het volume op 400 ml met LB. Schudden
3. Incubeer bij 60 ° C gedurende 1 uur.
4. Afkoelen tot kamertemperatuur.
5. Voeg 40ml van de OP50-1. Schudden
6. Verdeel 5-8 mL van het mengsel per plaat.
7. Laat platen een nacht af te wikkelen bij kamertemperatuur.

Dag 3:

1. Giet de overgebleven vloeistof uit platen. Laat met deksel drogen op bij kamertemperatuur gedurende de nacht.

Dag 4:

1. Doe platen in een doos of een plastic zak en bewaar bij 4 ° C totdat het nodig is. Deze platen lijken op OK om te gebruiken voor 1-2 maanden.

2. Zaaien Egg Platen

1. Vouw de DP38 wormen op 6 cm NGA platen door toevoeging van geconcentreerde OP50 de laatste tijd uitgehongerd platen. Voor een enkele bombardement, maken we gebruik ~ 6 kleine platen om zaad 5 ei platen. Voor meerdere bombardementen, gebruiken we de kleine plaatjes om in plaats daarvan zaad 2 verrijkt pepton borden voor het zaaien het ei platen.
2. Isoleer eieren van de DP38 wormen via het gebruik van hypochloriet ^13,14. Resuspendeer de eieren in steriele S-basale of M9 buffers ^13,14.
3. Voeg de eieren (> 10.000 per plaat) naar het juiste aantal eieren platen. Groeien de wormen op ei-platen bij 20 ° C gedurende 7-10 dagen om te gebruiken voor bombardement. De platen zijn klaar voor gebruik zodra de wormen zijn begonnen met het eten uit de platen. Deze platen zijn echt moeilijk te verhongeren en groeiende voor langere looptijden zullen worm rendement te verhogen.

Bombardement

Wij bereiden de goudvoorraad van tevoren en bewaar deze opgeslagen bij 4 ° C voor gebruik. Ook nodig zijn, zijn onbevlekt en gevlekte 10 cm NGA platen. De onbevlekt platen moeten goed worden gegoten van te voren en liet goed laten drogen om de absorptie van de vloeistof toegevoegd met de wormen te vergemakkelijken.

Op de dag van het bombardement, we wassen de wormen dan eerst beginnen met het voorbereiden van de DNA-gecoate gouddeeltjes. Dan voegen we de wormen aan het onbevlekt NGA platen en afwerking wassen van de gouddeeltjes en over te dragen naar de macrocarriers.

Goud deeltje voorbereiding:

1. Weeg 60 mg van goud deeltjes in een 1.7mL buis en genieten in 70% ethanol voor 15min. Spin kort voor het neerslaan van de gouddeeltjes.
2. Was drie maal in steriel water en de spin kort elke keer om het goud te verzamelen.
3. Resuspendeer de goud in 1 ml van 50% steriele glycerol. Dit is de voorraad goud deeltje oplossing en kan worden opgeslagen voor maanden bij 4 ° C.

Worms:

1. Drijven de DP38 wormen uit het ei platen met S-basale of M9 buffer en overbrengen naar een 50 ml conische buis.
2. Houd de buizen op de bank totdat de wormen in de bodem. Dan aspireren de buffer en voeg verse S-basale of M9. Was 2 of 3 keer, tot de buffer is relatief vrij van puin. Houd de wormen in deze stap totdat het DNA-coating is voltooid.
3. Aspireren en laat ca. 2-3 ml van wormen in buffer per bombardement. Transfer naar een 10 cm onbevlekt NGA plaat op ijs. Het is belangrijk dat het minimaliseren van de overgedragen volume als de NGA plaat moet volledig drogen voordat bombardement. Zorg ervoor dat u het gehele oppervlak van de plaat uit met de wormen.
4. Laat plaat te drogen op het ijs. Het ijs wordt voorkomen dat de wormen uit klonteren tijdens het drogen.

Deze stap is belangrijk: de plaat moet droog zijn en de wormen gelijkmatig verspreid op de NGA plaat. Houd de wormen op ijs verhindert hen te bewegen op het bord en aggregeren in stapels.

DNA voorbereiding (voor een bombardement):

1. Meng in een 1.7mL buis:
   • 50μl gouddeeltjes. Resuspendeer goed voor het toevoegen.
   • 50μl DNA (10-15 ug). We zien weinig verschil tussen circulair of lineair DNA. Meestal gebruiken we Qiagen midiprep cartridges voor DNA-zuivering (Qiagen Inc, Valencia, CA).
   • 50μl 2.5M CaCl _2. Deze oplossing is stabiel gedurende enkele weken bij kamertemperatuur.
   • 20μl 0,1 M spermidine.
     
     De spermidine is instabiel in waterige oplossing. Wij maken 70μl spermidine aliquots en bewaar bij -20 ° C. We dan 1 ml water toe te voegen recht voor gebruik om een ​​0,1 M oplossing te verkrijgen. Deze oplossing moet vers worden bereid voor elke bombardement.
     
     We meestal vortex het goud deeltjes in een 1.7mL buis bij een lage snelheid en voeg dan de CaCl _2, DNA en spermidine / protamine druppelsgewijs tijdens vortexen. Voor de mensen die zijn getransfecteerd met calciumfosfaat deze techniek vertrouwd is.
     
     We hebben tevens gebruikt protamine in plaats van spermidine met zeer goede resultaten ^15. We bereiden een verse oplossing (1mg/ml) in water en onse 50μl in plaats van de 20μl van spermidine. Als we gebruik van protamine, we meestal uitbroeden van het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in plaats van het op ijs. Protamine hoeft niet te worden bewaard bevroren en is een poeder in plaats van een vloeistof.
2. Incubeer dit mengsel op ijs gedurende 30 minuten, en periodiek te mixen om de goud deeltjes in suspensie te houden. Vervolgens kort draaien en zuig het supernatant.
3. Was met 300μl 70% ethanol. Spin kort.
4. Wassen met 1 ml 100% ethanol. Spin kort.
5. Resuspendeer in 170μl 100% ethanol.

Voorbereiding van de macrocarriers:

1. Spoel 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) in 2-propanol. Leg ze op zijdepapier en laat ze drogen op kamertemperatuur.
2. Voeg 20μl van DNA / goud mengsel op het midden van elke macrocarrier. Zorg ervoor dat u vortex net voor pipetteren om het goud in suspensie te houden.
3. Laat de ethanol verdampen.

3. Bombardement

Zorg ervoor dat u een blanco bombardement uit te voeren voordat het experiment om helium spoelen door het systeem.

1. Zet vacuümpomp en sluit vacuümpomp val. We maken gebruik van een olie-vrije vacuümpomp.
2. Zet helium tank. Controleer of de druk ≥ 2200psi.
3. Natte breekplaat (1350 psi) in 2-propanol, het plaatsen in het behoud cap voor hepta adapter.
4. Schroef adapter in PDS-1000-systeem en draai met de bijgeleverde momentsleutel.
5. Plaats de 7 macrocarriers in de houder en plaats ze met de bijgeleverde tool. Zet dan een hepta stop scherm en de bodem op aan de houder. Flip de houder over en leg ze op de tweede plank van boven. Het goud gevlekte zijde van de macrocarriers moet naar beneden op dit punt.
6. Lijn de gaten in de bovenkant van de macrocarrier houder met de uitlaten van de hepta adapter.
7. Plaats de NGA plaat gecoat met wormen (deksel) op de onderste plank in bombardement kamer.
8. Volledig open het vacuüm debiet knop van de PDS-1000. Druk op vac knop totdat kamer bereikt 26 Hg. Vervolgens overschakelen naar positie om het vacuüm te behouden vast te houden.
9. Houd het vuur ingedrukt totdat schijf breuken. Dit zal gebeuren wanneer de druk bereikt 1350psi. Soms is dit duurt 50 tot 20 seconden voor te komen. Laat de knop los.
10. Laat vacuüm van kamer (vent positie), en verwijder plaat.
11. Draai vacuüm en helium uit.
12. Brand meerdere keren totdat de lijn bevat geen helium (helium meter moet 0 psi mark).
13. Zet de PDS-1000-systeem.

Worm herstel na bombardement:

1. Laat de gebombardeerd plaat bij 20 ° C gedurende 20 minuten.
2. Drijven de wormen van de plaat met 10 ml S-basale of M9 buffer.
3. Zet 0,5 ml wormen op 20 - 10 cm gespot NGA platen.
4. Laat bij 20 ° C of kamertemperatuur (22-24 ° C) voor ongeveer 2 weken voor het controleren op wormen gered.
5. Scherm voor de wormen met de unc-119 (+) fenotype met een dissectie microscoop. De optimale tijd voor screening is na de platen hebben honger, omdat de geredde wormen hebben te overleven voordeel ten opzichte van niet-gered wormen.
6. Het genereren van een individuele lijn van elk 10 cm bord dat de geredde wormen bevatten.

4. Representatieve resultaten

Het succes van het protocol met betrekking tot het verkrijgen van transgene dieren is afhankelijk van de specifieke transgen. Voor de promotor: GFP reporter transgenen we hebben verkregen tot 20 lijnen. Een typisch resultaat is 30 tot 10 lijnen. Tot 30% van de transgene lijnen zijn geïntegreerd lijnen, maar dit is willekeurig en wij zullen meerdere bombardementen uitvoeren op een enkele dag als een geïntegreerde lijn is in het bijzonder gewenst is.

Discussion

Biolistische bombardement is een eenvoudige methode om vreemd DNA te introduceren in vele organismen, met inbegrip C. elegans ^1,5,6,7,16. Het vertrouwt op gouddeeltjes het vormen van een complex met DNA in de aanwezigheid van CaCl _2. Kationische polyaminen, zoals spermidine, beschermen DNA van nuclease degradatie in vivo. Omdat spermidine is een labiel molecule, is het belangrijk om het op te slaan in kleine porties bij -20 ° C, en de oplossing te maken vlak voor het uitvoeren van het bombardement. Zoals we beschreven in het bombardement protocol, kan protamine in plaats van spermidine worden gebruikt voor het vreemde DNA te leveren ^15. Protamine heeft het voordeel dat meer stabiel bij kamertemperatuur en wordt een poeder in plaats van een stroperige vloeistof.

De UNC-119 rescue-gen kan worden geplaatst in cis op hetzelfde plasmide als het transgen of op een aparte plasmide dat wordt gemengd met het transgen voorafgaand aan het coaten van de gouddeeltjes. Terwijl het mengen van een of meerdere plasmiden is meestal succesvol, hebben wij en anderen vonden dat bombardement van wormen met meerdere plasmiden kunnen transgene dieren vervoer van een aantal te maken, maar niet alle plasmiden ^6,11. Om de plaatsing van de unc-119 gen op het transgen plasmide, hebben we onlangs beschreven een protocol met behulp van homologe recombinatie aan de unc-119 gen in te voegen in de ampicilline resistentie-gen van bijna alle plasmiden ^11.

Verder, bewegende transgenen te vergemakkelijken van de DP38 zeef in worm stammen ontbreekt de unc-119 mutatie, hebben we ook geleid tot een plasmide met unc-119 gefuseerd met mCherry ^11. De pan-neuronale mCherry fluorescentie kan vervolgens worden gebruikt om de aanwezigheid van het transgen in een verscheidenheid van genetische achtergronden ¹¹ track.

Sommige transgenen kan moeilijk op te sporen na bombardement te wijten aan zwakke uitdrukking of een podium specifieke uitdrukking. De aanwezigheid van het transgen kan vaak worden gecontroleerd via het gebruik van PCR met behulp van de transgene wormen. Voor de transgenen met zwakke expressie, kan het uitvoeren van extra bombardementen leiden tot de identificatie van de lijnen met sterkere expressie. Als alternatief kan het gebruik van een verbinding of confocale microscoop vaak helpen bij het visualiseren van de expressie van fluorescerende eiwitten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold particles	Inbio gold	BD021	1micron
Midiprep kit	Qiagen	12143
Spermidine	Sigma-Aldrich	S4139
Protamine	Sigma-Aldrich	P4505
Macrocarriers	Bio-Rad	165-2335
PDS-1000/He Hepta System	Bio-Rad	165-2257
Rupture disk	Bio-Rad	165-2330
Nystatin	Sigma-Aldrich	N1638
Streptomycin	MP Biomedicals	100556