Generering av Transgena C. elegans Genom Biolistic Transformation

Summary

Transgena maskar används ofta i

Protocol

Översikt

Traditionellt transgena maskarna genererades av microinjecting transgenen DNA i C. elegans könsceller ^1,2,3,4. Medan framgångsrika, krävs detta tillvägagångssätt specialutrustning och utveckling av erfarenheter med mask anatomi och mikroinjektion teknik. På senare tid biolistic bombardemang har utvecklats som en alternativ metod som använder DNA-belagda guldpartiklar att introducera främmande DNA i könsceller ^5,6. Denna metod kräver mindre investering i tid i form av praktik för att bli framgångsrik.

Den biolistic bombardemang av C. elegans för att skapa transgena maskarna har låg verkningsgrad i nivå med de enskilda masken så lyckas krävs en stor mängd djur. Dessa kan odlas på flera sätt, men vi använder ägg plattor för att minska arbete och antalet inblandade plattor. Vårt protokoll börjar med beredning av ägg tallrikar och maskar och sedan fokuserar på beskjutningen protokoll med Bio-Rad PDS-1000/He hepta System. Vi anpassat våra protokoll delvis arbete Berezikov et al ^7.

Med bombardemang är UNC-119 genen som vanligtvis används som markör för transgena djur. Worm stammar som bär denna mutation är kraftigt okoordinerade och knappt röra sig, är dumpy i utseende, och kan inte bilda Dauer larver ^8. Den Dauer är en alternativ larvstadiet som används för att fördröja utveckling till en reproduktiv vuxen under ogynnsamma förhållanden, och träder i Dauer regleras av flera gener ^9. Flera stammar som bär UNC-119 gen är tillgängliga från C. elegans Genetics Center (CGC, Minneapolis, MN). Den ursprungliga DP38 stam (UNC-119 (ed3)) genomför även en oberoende Dauer-formation konstitutiva (DAF-c) mutation som kan påverka nedströms experiment. Flera laboratorier har utparade denna mutation, och HT1593 stammen är tillgänglig från CGC. Vi finner att transgena djur är något lättare att identifiera sig med DP38 påfrestningar och tenderar att använda den här stammen för att skapa transgena djur. Vid behov använder vi HT1593 för att utparning den transgena maskarna att ta bort DAF-C mutationen. Att få DP38 maskarna att växa är en av de långsammaste steg i protokollet så vi upprätthåller ett lager av växande tallrikar medan du förbereder transgener.

Redovisning av UNC-119 markör tillsammans med genen av intresse gör det lätt att identifieringen av djuren uttrycka transgenen baserat på räddning av normal rörlighet och kroppsstorlek ^5. UNC-119 genen kan erhållas från flera källor, och vektorer med hjälp av UNC-119 genomisk DNA, UNC-119 promotor och cDNA och genomiska DNA för den mindre C. briggsiae gen används ^8,10. Vi har nyligen beskrivit ett enkelt protokoll för att lägga till en UNC-119 kassett till en plasmid som innehåller en ampicillin motstånd gen med hjälp av homolog rekombination ¹¹ och en metod för att ändra masken fosmids att bära UNC-119 gen av Cre-LOX rekombination för att generera transgena djur ^12. Den plasmider finns från Addgene Inc. (Cambridge, MA).

Medan insats som krävs för att utföra en enda bombardemang är betydande men hanterbar, är det extra arbetet med att utföra flera bombningar på en enda dag minimal. Därför kluster vi rutinmässigt produktionen av transgena maskar för att minska arbetet med att skapa varje.

1. Egg Plate Förberedelser

UNC-119 muterade maskar är svåra att odla på standard NGM tallrikar eftersom deras rörelsehinder tenderar de att svälta på delar av en tallrik medan andra delar av plattan fortfarande innehålla mat. Ägg plattor lösa detta problem så den tjocka maten lager på ägg plattor låter UNC-119 maskar krypa lättare och att ta över hela plattan ^7. Ägget plattor har även fördelen att stödja framväxten av ett stort antal maskar så att färre plattor behövs ^13. Vanligtvis 5 ägg plattorna räcker för att odla maskar för en beskjutning. Receptet nedan gör ungefär 50 plattor, men kan halveras för att göra mindre om så önskas.

Ägget plattor kan lätt bli förorenad så vi använder både antibiotika och läkemedel mot svamp i plattorna och endast använda ägg som genereras av hypoklorit behandling för sådd plattorna.

Dag 1:

1. Förbered LB (400 ml) i en 500 ml flaska. Autoklav 20min.
2. Häll ~ 50 10 cm NGA plattor med 1 liter NGA med 2% agar. Vi lägger nystatin 10 ml per liter och streptomycin till 200 mikrogram / ​​ml ^13.
3. Odla ett 40 mL natten kultur OP50-1 i LB med 200 mikrogram / ml streptomycin. Denna sort är streptomycin resistent och tillgängliga från CGC.
4. Autoklav en 500ml flaska förnästa dag.

Dag 2:

1. Separat äggulorna av 10 hönsägg i steril flaska. Vi använder en äggula separator (finns på hushållsnivå butiker, inklusive Target). Shake.
2. Ta volym 400ml med LB. Shake
3. Inkubera vid 60 ° C i 1 timme.
4. Svalna till rumstemperatur.
5. Tillsätt 40 ml av OP50-1. Shake
6. Fördela 5-8 ml av blandningen per platta.
7. Låt plattorna för att reglera i rumstemperatur över natten.

Dag 3:

1. Häll försiktigt bort kvarvarande vätska från plattor. Låt torka med lock på i rumstemperatur över natten.

Dag 4:

1. Lägg plattorna i en låda eller plastpåse och förvara vid 4 ° C tills det behövs. Dessa skyltar verkar vara OK att använda i 1-2 månader.

2. Seedning Egg Plattor

1. Expandera DP38 maskar på 6 cm NGA plattor genom tillsats av koncentrerad OP50 till nyligen svalt tallrikar. För en enda bombardemang använder vi ~ 6 assietter till utsäde 5 ägg plattor. För flera beskjutningar använder vi assietter istället frö 2 berikat pepton plattor innan sådd ägget plattorna.
2. Isolera ägg från DP38 maskar via användning av hypoklorit ^13,14. Resuspendera ägg i sterila S-basala eller M9 buffertar ^13,14.
3. Tillsätt ägg (> 10,000 per platta) för att rätt antal ägg plattor. Odla maskar på ägget plattorna vid 20 ° C i 7-10 dagar att använda för beskjutning. Plattorna kommer att vara redo att använda när maskarna har börjat rensa mat från plattorna. Dessa skyltar är verkligen svårt att svälta och växande på längre löptider kommer att förbättras masken avkastning.

Beskjutning

Vi förbereder guldet beståndet i förväg och hålla den förvaras vid 4 ° C för användning. Det behövs också obefläckad och fläckig 10 cm NGA plattor. Den obefläckade plattorna måste hällas i god tid och tillåtas att torka för att underlätta absorption av vätska tillsätts med maskar.

På dagen av bombningarna, tvätta vi bort maskarna först sedan börja förbereda DNA-belagda guldpartiklar. Vi lägger då maskarna till obefläckad NGA tallrikar och avsluta tvätta guldpartiklar och överföra dem till macrocarriers.

Guld partikel förberedelser:

1. Väg 60 mg av guld partiklar i ett 1,7 ml rör och blötlägg i 70% etanol för 15min. Spin kortfattat att fälla ut guldpartiklar.
2. Tvätta tre gånger i sterilt vatten och snurra ett ögonblick varje gång att samla guld.
3. Resuspendera guld i 1 mL 50% steril glycerol. Detta är beståndet guld partikel-lösning och kan lagras i flera månader vid 4 ° C.

Worms:

1. Flyta DP38 maskar ur ägget tallrikar med S-basal eller M9 buffert och överföra dem till en 50mL koniska rör.
2. Håll rören på bänken tills maskar är i botten. Sedan aspirera buffert och tillsätt färsk S-basala eller M9. Tvätta 2 eller 3 gånger, tills bufferten är relativt fri från skräp. Håll maskar i detta steg tills DNA-beläggningen är klar.
3. Aspirera och lämna ca 2-3 ml maskar i buffert per bombardemang. Överför till en 10 cm obefläckad NGA tallrik på is. Det är viktigt att minimera den överförda volymen eftersom NGA plattan måste torka helt innan bombardemanget. Var noga med att täcka hela ytan av plattan med maskarna.
4. Låt plattan torka på is. Isen kommer att förhindra maskar från klumpar under torkningen.

Detta steg är viktigt: plåten skall vara torr och maskarna jämnt fördelade på NGA plattan. Att hålla masken på is hindrar dem från att röra sig på tallriken och samla i högar.

DNA-preparation (för en beskjutning):

1. Blanda i ett 1,7 ml rör:
   • 50μl guldpartiklar. Resuspendera ordentligt innan du lägger till.
   • 50μl DNA (10-15ug). Vi ser ingen större skillnad mellan cirkulär eller linjär DNA. Vanligtvis använder vi Qiagen midiprep patroner för DNA-rening (Qiagen Inc., Valencia, CA).
   • 50μl 2.5M CaCl _2. Denna lösning är stabil i flera veckor i rumstemperatur.
   • 20μl 0,1 miljoner spermidine.
     
     Den spermidine är instabilt i vattenlösning. Vi gör 70μl spermidine alikvoter och förvara vid -20 ° C. Vi lägger sedan 1 mL vatten precis innan används för att erhålla en 0,1 M lösning. Denna lösning måste beredas på nytt för varje beskjutning.
     
     Vi brukar virvel av guldpartiklar i ett 1,7 ml rör på låg hastighet och sedan lägga till CaCl _2, DNA och spermidine / protamin droppvis medan vortexa. För de människor som har transfererats med kalciumfosfat denna teknik är bekant.
     
     Vi har också använt protamin istället för spermidine med mycket goda resultat ^15. Vi förbereder en ny lösning (1mg/ml) i vatten och osse 50μl istället för 20μl av spermidine. Om vi ​​använder protamin, inkubera vi brukar blandningen i rumstemperatur i 10 minuter istället för att placera på is. Protamin behöver inte förvaras fryst och är ett pulver i stället för en vätska.
2. Inkubera blandningen på is 30min, och periodvis mix för att hålla guldpartiklar i suspension. Sen spin kort och aspirera supernatanten.
3. Tvätta med 300μl 70% etanol. Spin kort.
4. Tvätta med 1 mL 100% etanol. Spin kort.
5. Resuspendera i 170μl 100% etanol.

Beredning av macrocarriers:

1. Skölj 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) i 2-propanol. Lägg dem på papper och låt dem torka i rumstemperatur.
2. Tillsätt 20μl av DNA / guld blandningen i mitten av varje macrocarrier. Var noga med att skaka precis innan pipettera att hålla guld i suspension.
3. Låt etanolen avdunstar.

3. Beskjutning

Var noga med att utföra en tom bombardemang före försöket att spola helium genom systemet.

1. Slå på vakuumpumpen och nära vakuumpump fälla. Vi använder en oljefri vakuumpump.
2. Slå på helium tank. Kontrollera att trycket ≥ 2200psi.
3. Våt sprängbleck (1350 psi) i 2-propanol, placering i behålla hatten för hepta adapter.
4. Skruva adapter till PD-1000-systemet och dra åt med medföljande momentnyckel.
5. Placera 7 macrocarriers i hållaren och säte dem med det medföljande verktyget. Sedan satte en hepta stopp skärm och botten på till innehavaren. Vänd på hållaren över och lägg på den andra hyllan uppifrån. Guldet prickiga sidan av macrocarriers måste vara vänd nedåt på denna punkt.
6. Rikta in hålen i toppen av macrocarrier hållaren med uttag av hepta adaptern.
7. Placera NGA platta med maskar (locket) på den lägsta hyllan i bombardemanget kammare.
8. Helt öppna vakuum flöde ratten på PDS-1000. Tryck vac-knappen tills kammare når 26 I Hg. Byt sedan att hålla stånd att upprätthålla vakuum.
9. Tryck och håll elden tills skivan spricker. Detta sker när trycket når 1350psi. Ibland tar 5-20 sekunder att inträffa. Släpp knappen.
10. Släpp vakuum från kammaren (ventil position), och ta bort plattan.
11. Vänd vakuum och helium av.
12. Brand flera gånger tills raden inte innehåller helium (helium gauge bör markera 0 psi).
13. Stäng av PDS-1000-system.

Worm återhämtning efter bombningar:

1. Lämna bombarderas plattan vid 20 ° C i 20 minuter.
2. Float maskarna från plattan med 10 ml S-basala eller M9 buffert.
3. Sätt 0,5 mL maskar på 20 - 10 cm fläckig NGA plattor.
4. Lämna vid 20 ° C eller rumstemperatur (22-24 ° C) i ca 2 veckor innan kontroll för räddade maskar.
5. Skärm för maskar med UNC-119 (+) fenotyp med en dissekera mikroskop. Den optimala tiden för screening efter att plattorna har svultit sedan räddade maskarna har överlevnadsfördel över icke-räddade maskar.
6. Generera en enskild linje från var 10 cm tallrik som innehöll räddade maskar.

4. Representativa resultat

Framgången av protokollet när det gäller att få transgena djur beror på särskilda transgenen. För arrangören: transgener GFP reporter vi har fått upp till 20 linjer. Ett mer typiskt resultat är 3-10 rader. Upp till 30% av de transgena linjerna är integrerade linjer, men det är slumpmässigt och vi kommer att utföra flera beskjutningar på en enda dag om en integrerad linje är särskilt önskvärt.

Discussion

Biolistic bombardemang är en enkel metod att introducera främmande DNA i många organismer, inklusive C. elegans ^1,5,6,7,16. Det är beroende av guldpartiklar bildar ett komplex med DNA i närvaro av CaCl _2. Katjoniska polyaminer, såsom spermidine, skydda DNA från nukleas nedbrytning in vivo. Eftersom spermidine är ett instabilt molekyl, är det viktigt att förvara det i små alikvoter vid -20 ° C, och göra lösningen rätt innan du utför bombardemanget. Som vi beskrev i beskjutningen protokollet kan protamin användas i stället för spermidine att leverera främmande DNA ^15. Protamin har fördelen av att vara mer stabil vid rumstemperatur och är ett pulver i stället för en trögflytande vätska.

UNC-119 räddnings-genen kan placeras antingen i cis på samma plasmiden som transgenen eller på en separat plasmid som blandas med transgenen före beläggning guldpartiklar. Medan blandning av en eller flera plasmider är oftast framgångsrik, har vi och andra funnit att bombardemanget av maskar med flera plasmider kan skapa transgena djur bär vissa, men inte alla plasmider ^6,11. För att underlätta att placera UNC-119 genen på transgenen plasmiden beskrev vi nyligen ett protokoll med hjälp av homolog rekombination att infoga UNC-119 gen i ampicillin resistensgen av nästan alla plasmider ^11.

Vidare underlätta övergång transgener från DP38 sila upp i masken stammar saknar UNC-119 mutation, genererade vi också en plasmid med UNC-119 smält till mCherry ^11. Den pan-neuronala mCherry fluorescens kan då användas för att spåra förekomsten av transgenen i olika genetisk bakgrund ^11.

Vissa transgener kan vara svåra att upptäcka efter bombningar på grund av svag uttryck eller en scen specifikt uttryck. Närvaron av transgenen kan verifieras ofta genom användning av PCR med hjälp av transgena maskarna. För transgener med svaga uttryck kan utföra ytterligare bombningarna leda till identifiering av linjer med starkare uttryck. Alternativt kan användning av en förening eller konfokalmikroskop ofta hjälpa med att visualisera ett uttryck för fluorescerande proteiner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold particles	Inbio gold	BD021	1micron
Midiprep kit	Qiagen	12143
Spermidine	Sigma-Aldrich	S4139
Protamine	Sigma-Aldrich	P4505
Macrocarriers	Bio-Rad	165-2335
PDS-1000/He Hepta System	Bio-Rad	165-2257
Rupture disk	Bio-Rad	165-2330
Nystatin	Sigma-Aldrich	N1638
Streptomycin	MP Biomedicals	100556