Génération de souris transgéniques C. elegans Par transformation biolistique

Summary

Des vers transgéniques sont couramment utilisés dans

Abstract

Le nombre de laboratoires utilisant le C nématodes vivant libre elegans est en croissance rapide. La popularité de ce modèle biologique est attribué à un temps de génération rapide et courte durée de vie, entretien facile et peu coûteux, génome entièrement séquencé, et le tableau des ressources et des animaux mutants ARNi. De plus, l'analyse de la C. elegans du génome a révélé une grande similitude entre les vers et les vertébrés supérieurs, ce qui suggère que la recherche dans les vers pourrait être un complément important aux études effectuées chez la souris tout ou cellules cultivées. Une partie puissant et important de la recherche ver est la possibilité d'utiliser des animaux transgéniques pour étudier la localisation des gènes et leur fonction. Les animaux transgéniques peuvent être créées soit par micro-injection de la lignée germinale ver ou par l'utilisation de bombardement biolistique. Bombardement est une technique plus récente et est moins familier à un certain nombre de laboratoires. Nous décrivons ici un protocole simple de générer des vers transgéniques par bombardement biolistique avec des particules d'or en utilisant le Bio-Rad PDS-1000 du système. Par rapport à la microinjection d'ADN dans les cellules germinales hermaphrodites, ce protocole a l'avantage de ne pas nécessiter de compétences particulières de l'opérateur en ce qui concerne l'identification d'anatomie ver ou d'effectuer la microinjection. En outre plusieurs lignées transgéniques sont généralement obtenus à partir d'un bombardement unique. Aussi, contrairement à la micro-injection, bombardement biolistique produit des animaux transgéniques avec les deux tableaux extrachromosomique et des transgènes intégrés. La capacité d'obtenir des lignées transgéniques intégrés permet d'éviter l'utilisation de protocoles mutagène d'intégrer l'ADN étranger. En conclusion, le bombardement biolistique peut être une méthode intéressante pour la production d'animaux transgéniques, en particulier pour les enquêteurs ne s'intéressent pas à investir le temps et les efforts nécessaires pour devenir habile à la microinjection.

Protocol

Aperçu

Traditionnellement les vers transgéniques ont été générées par micro-injection d'ADN transgénique dans le C. elegans germinale ^1,2,3,4. Bien réussie, cette approche nécessitait des équipements spécialisés et le développement de l'expérience avec l'anatomie ver et la technique de micro-injection. Plus récemment bombardement biolistique a été développé comme une autre approche qui utilise des particules d'or enrobées d'ADN pour introduire un ADN étranger dans le ^5,6 germinale. Cette approche exige un investissement de moins de temps en termes de pratique pour réussir.

Le bombardement biolistique de C. elegans pour générer des vers transgéniques a une faible efficacité au niveau du ver individuels afin de succès nécessite une grande quantité d'animaux. Ceux-ci peuvent être cultivées de diverses façons, mais nous utilisons des plaques d'oeuf afin de réduire le travail et le nombre de plaques impliquées. Notre protocole commence avec la préparation des plaques d'œufs et les vers, puis se concentre sur le protocole de bombardement à l'aide de la Bio-Rad PDS-1000/He Hepta système. Nous avons adapté notre protocole en partie de travaux de Berezikov et al ^7.

Avec les bombardements, le gène unc-119 est généralement utilisé comme marqueur pour les animaux transgéniques. Worm souches portant cette mutation sont sévèrement coordination et à peine bouger, sont plutôt moche en apparence, et sont incapables de former des larves dauer ^8. Le dauer est une étape de remplacement des larves qui est utilisée pour retarder le développement d'un adulte reproducteur dans des conditions défavorables, et l'entrée en dauer est réglementée par de multiples gènes ^9. Plusieurs souches porteuses du gène unc-119 sont disponibles à partir du C. elegans Genetics Center (CGC, Minneapolis, MN). L'original DP38 souche (UNC-119 (ED3)) effectue également une formation sans lien avec Dauer-constitutifs (daf-c) mutation qui pourrait affecter les expériences en aval. Plusieurs laboratoires ont outcrossed cette mutation, et la souche HT1593 est disponible à partir de la CCG. Nous trouvons que les animaux transgéniques sont un peu plus facile à identifier avec la souche DP38 et ont tendance à utiliser cette souche pour la création d'animaux transgéniques. Lorsque nécessaire, nous utilisons HT1593 au croisement des vers transgéniques pour enlever la mutation daf-c. Obtenir le DP38 les vers de se développer est l'une des plus lentes étapes dans le protocole afin que nous conserver un stock de plaques de croissance tout en préparant les transgènes.

L'expression du marqueur unc-119 avec le gène d'intérêt permet d'identifier facilement les animaux exprimant le transgène basée sur le sauvetage de la motilité normale et ⁵ la taille du corps. L'UNC-119 du gène peut être obtenu à partir de plusieurs sources, et les vecteurs en utilisant l'ADN génomique unc-119, unc-119 promoteur et d'ADNc, et l'ADN génomique pour les petits C. briggsiae gènes sont utilisés ^8,10. Nous avons récemment décrit un protocole simple d'ajouter une cassette unc-119 à un plasmide contenant un gène de résistance à l'ampicilline par recombinaison homologue ¹¹ et une méthode pour modifier fosmides ver pour porter le gène unc-119 par recombinaison Cre-lox pour générer des animaux transgéniques ^12. Les plasmides sont disponibles à partir Addgene Inc (Cambridge, MA).

Alors que les efforts impliqués dans l'exécution d'un bombardement unique est significatif mais gérable, le travail supplémentaire à effectuer des bombardements multiples sur une seule journée est minime. Par conséquent, nous avons l'habitude pôle de la production des vers transgéniques pour diminuer le travail nécessaire pour générer chacun.

1. La préparation des plaques d'oeufs

Les vers unc-119 mutantes sont difficiles à croître sur des plaques NGM standard, car grâce à leur mobilité réduite, ils ont tendance à mourir de faim sur les pièces d'une plaque en d'autres parties de la plaque encore contenir des aliments. Plaques d'œufs résoudre ce problème que la couche épaisse des aliments sur des plaques d'oeuf permet unc-119 vers de terre pour ramper plus facilement et à prendre sur toute la plaque ^7. Les plaques d'œufs ont également l'avantage de soutenir la croissance d'un grand nombre de vers afin que moins de plaques sont nécessaires ^13. Habituellement 5 plaques d'œufs sont suffisantes pour pousser les vers pour un bombardement. La recette ci-dessous fait environ 50 plaques, mais peuvent être réduits de moitié à faire moins, si désiré.

Les plaques d'oeuf peut devenir facilement contaminés afin que nous utilisons à la fois les antibiotiques et les antifongiques dans les plaques et de n'utiliser que des œufs produits par traitement à l'hypochlorite pour l'ensemencement des plaques.

Jour 1:

1. Préparer LB (400 ml) dans une bouteille de 500 ml. Autoclave pendant 20 minutes.
2. Verser environ 50 plaques de 10 cm en utilisant une NGA NGA litres avec 2% d'agar. Nous ajoutons nystatine 10 ml par litre et la streptomycine à 200 pg / mL ^13.
3. Cultiver une culture de 40 ml de nuit de OP50-1 dans LB avec 200 ug / ml de streptomycine. Cette souche est résistante la streptomycine et disponible auprès de la CCG.
4. Autoclave une bouteille de 500 ml pourlendemain.

Jour 2:

1. Séparez les jaunes d'œufs de poule 10 dans le flacon stérile. Nous utilisons un séparateur jaune (disponible dans les magasins des ménages, y compris la cible). Shake.
2. Amener le volume à 400 ml avec LB. Secouer
3. Incuber à 60 ° C pendant 1 heure.
4. Laisser refroidir à température ambiante.
5. Ajouter 40 ml d'OP50-1. Secouer
6. Distribuer 5-8 ml de mélange par plaque.
7. Laisser les plaques à régler à la température ambiante jusqu'au lendemain.

Jour 3:

1. Verser délicatement le liquide restant hors de plaques. Laisser sécher avec des couvercles sur les à température ambiante jusqu'au lendemain.

Jour 4:

1. Mettez les plaques dans une boîte ou un sac en plastique et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Ces plaques semblent être OK pour utiliser pendant 1-2 mois.

2. Semis Plaques Egg

1. Développez le DP38 vers sur 6 assiettes NGA cm en ajoutant OP50 concentrée sur des plaques récemment affamés. Pour un bombardement simple, nous utilisons ~ 6 petites assiettes à des plaques de semences oeuf 5. Pour de multiples bombardements, nous utilisons les petites plaques de semences au lieu plaques 2 enrichi peptonée avant d'ensemencer les plaques d'oeufs.
2. Isoler les œufs des vers DP38 via l'utilisation d'hypochlorite de ^13,14. Resuspendre les oeufs dans stériles tampons S-basale ou M9 ^13,14.
3. Ajouter les oeufs (> 10 000 par plaque) pour le nombre approprié de plaques d'oeuf. Cultivez les vers sur des plaques d'oeuf à 20 ° C pendant 7-10 jours pour l'utilisation d'un bombardement. Les plaques seront prêts à utiliser une fois que les vers ont commencé à effacer la nourriture de l'assiette. Ces plaques sont vraiment difficiles à affamer et croissante pour des durées plus longues seront d'améliorer le rendement ver.

Bombardement

Nous préparons le stock d'or à l'avance et le garder conservés à 4 ° C pour les utiliser. Il faut également des souillures et tachetée 10 cm plaques NGA. Les plaques doivent être sans tache versé à l'avance et a permis de sécher complètement pour faciliter l'absorption du liquide ajouté avec les vers.

Le jour du bombardement, nous laver les vers d'abord, puis commencer à préparer l'ADN des particules revêtues d'or. Nous ajoutons ensuite les vers sur les plaques sans tache NGA et terminer le lavage des particules d'or et de les transférer au macrocarriers.

Préparation de particules d'or:

1. Peser 60 mg de particules d'or dans un tube 1.7mL et laisser tremper dans de l'éthanol 70% pendant 15 min. Centrifuger brièvement pour précipiter les particules d'or.
2. Lavez 3 fois dans de l'eau stérile et centrifuger brièvement à chaque fois pour collecter de l'or.
3. Resuspendre l'or dans 1 ml de glycérol stérile à 50%. C'est la solution stock d'or et de particules peuvent être stockés pendant des mois à 4 ° C.

Worms:

1. Faites flotter le DP38 vers les plaques en oeuf avec le tampon S-basale ou M9 et les transférer à un tube de 50 ml conique.
2. Conserver les tubes sur le banc jusqu'à ce que les vers sont dans le fond. Puis aspirez le tampon et ajouter des nouvelles S-basale ou M9. Lavez 2 ou 3 fois, jusqu'à ce tampon est relativement claire de débris. Gardez les vers à cette étape jusqu'à ce que le revêtement ADN est terminée.
3. Aspirer et laisser environ 2-3 ml de tampon par des vers dans un bombardement. Transfert à une plaque de 10 cm NGA souillures sur la glace. Il est important de minimiser le volume transféré comme la plaque NGA auront besoin de sécher complètement avant de bombardement. Soyez sûr de couvrir toute la surface de la plaque avec les vers.
4. Laisser sécher la plaque sur la glace. La glace empêcher les vers de grumeaux pendant le séchage.

Cette étape est importante: la plaque doit être sec et les vers dispersé uniformément sur la plaque de NGA. Garder les vers sur la glace les empêche de se déplacer sur la plaque et l'agrégation en tas.

Préparation d'ADN (pour un bombardement):

1. Mélanger dans un tube 1.7mL:
   • 50 pl des particules d'or. Resuspendre soigneusement avant d'ajouter.
   • 50 pl d'ADN (10-15ug). Nous voyons peu de différence entre l'ADN circulaire ou linéaire. Habituellement, nous utilisons Qiagen cartouches Midiprep pour la purification d'ADN (Qiagen Inc, Valencia, CA).
   • 50 pl 2,5 M CaCl _2. Cette solution est stable pendant plusieurs semaines à température ambiante.
   • 20 pi 0,1 M spermidine.
     
     La spermidine est instable en solution aqueuse. Nous faisons aliquotes spermidine 70μl et conserver à -20 ° C. Nous ajoutons ensuite 1 ml d'eau juste avant l'utilisation pour obtenir une solution 0.1M. Cette solution doit être préparée fraîche pour chaque bombardement.
     
     En général, nous vortex les particules d'or dans un tube 1.7mL à basse vitesse et ajoutez le CaCl _2, de l'ADN et la spermidine / goutte à goutte tout en protamine vortex. Pour les gens qui ont transfectées avec du phosphate de calcium de cette technique est familière.
     
     Nous avons également utilisé la protamine lieu de spermidine avec de très bons résultats ^15. Nous préparons une nouvelle solution (1mg/ml) dans de l'eau et nouse 50 pl au lieu de la 20 pi de spermidine. Si nous utilisons la protamine, nous avons l'habitude incuber le mélange à la température ambiante pendant 10 minutes au lieu de placer sur la glace. Protamine n'a pas besoin d'être conservés congelés et est une poudre au lieu d'un liquide.
2. Incuber le mélange sur la glace pendant 30 minutes, mélangez et périodiquement pour maintenir les particules d'or en suspension. Puis centrifuger brièvement et aspirer le surnageant.
3. Laver avec de l'éthanol 300μl de 70%. Spin brièvement.
4. Laver avec de l'éthanol à 100% 1ml. Spin brièvement.
5. Remettre en suspension dans 170μl d'éthanol 100%.

Préparation de macrocarriers:

1. Rincez 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) dans le 2-propanol. Mettez-les sur du papier absorbant et les laisser sécher à température ambiante.
2. Ajouter 20 pi de l'ADN / or mélange au centre de chaque macrosupport. Soyez sûr à droite avant le vortex de pipetage pour garder l'or en suspension.
3. Laissez l'éthanol s'évapore.

3. Bombardement

Veillez à effectuer un bombardement vierge avant l'expérience de rincer l'hélium dans le système.

1. Mettez la pompe à vide et fermer piège pompe à vide. Nous utilisons une pompe à vide sans huile.
2. Allumez le réservoir d'hélium. Vérifier que la pression est ≥ 2200psi.
3. Disque de rupture Wet (1350 psi) dans le 2-propanol, la mise en conservant plafond pour hepta adaptateur.
4. Vis adaptateur dans PDS-1000 du système et serrez avec la clé dynamométrique fournie.
5. Placez le 7 macrocarriers dans le support et le siège avec l'outil fourni. Puis mettre un écran d'arrêt hepta et le fond sur le support. Retournez le support et placez sur la deuxième étagère du haut. Le côté or repéré de l'macrocarriers doit être orientée vers le bas à ce point.
6. Alignez les trous dans le haut du porte-macrosupport avec les prises de l'adaptateur hepta.
7. Placer la plaque recouverte d'NGA vers (hors couvercle) sur l'étagère du bas dans la chambre de bombardement.
8. Totalement ouvert le vide débit bouton sur le PDS-1000. Appuyez sur le bouton jusqu'à ce vac chambre atteint 26 En Hg. Puis passez à tenir la position pour maintenir le vide.
9. Appuyez et maintenez le bouton de tir jusqu'à ce ruptures disque. Cela se produira lorsque la pression atteint 1350psi. Parfois, cela prend 50 à 20 secondes pour se produire. Relâchez le bouton.
10. Communiqué de vide de la chambre (position d'évent), et retirez la plaque.
11. Tourner à vide et hors d'hélium.
12. Incendie à plusieurs reprises jusqu'à la ligne ne contient pas d'hélium (jauge d'hélium doit marquer 0 psi).
13. Éteignez le système PDS-1000.

La récupération après le bombardement Worm:

1. Laisser la plaque bombardés à 20 ° C pendant 20 minutes.
2. Float les vers de la plaque avec 10 ml de tampon S-basale ou M9.
3. Mettez les vers 0.5mL le 20 - 10 cm repéré plaques NGA.
4. Laisser à 20 ° C de température ou la salle (22-24 ° C) pendant environ 2 semaines avant de vérifier les vers secourus.
5. Ecran pour les vers avec le phénotype unc-119 (+) avec un microscope à dissection. Le moment optimal pour le dépistage est, après les plaques ont faim, depuis les vers ont sauvé avantage de survie par rapport aux non-secourues vers.
6. Générer une ligne individuelle de chaque plaque de 10 cm qui contenaient des vers secourus.

4. Les résultats représentatifs

Le succès du protocole en ce qui concerne l'obtention d'animaux transgéniques dépend du transgène particulier. Pour le promoteur: transgènes rapporteur GFP, nous avons obtenu jusqu'à 20 lignes. Un résultat plus typique est de 30 à 10 lignes. Jusqu'à 30% des lignées transgéniques sont des lignes intégrées, mais cela est aléatoire et nous allons effectuer des bombardements multiples sur une seule journée, si une ligne intégrée est particulièrement souhaitée.

Discussion

Bombardement biolistique est une méthode simple pour introduire un ADN étranger dans de nombreux organismes, y compris C. elegans ^1,5,6,7,16. Elle repose sur des particules d'or formant un complexe avec l'ADN en présence de CaCl _2. Polyamines cationiques, tels que la spermidine, de protéger l'ADN de la dégradation de la nucléase in vivo. Depuis la spermidine est une molécule instable, il est important de le stocker dans de petites aliquotes à -20 ° C, et de faire la bonne solution avant d'effectuer le bombardement. Comme nous l'avons décrit dans le protocole de bombardement, de protamine peut être utilisé à la place de la spermidine pour livrer ADN étranger ^15. Protamine a l'avantage d'être plus stable à la température ambiante et d'être une poudre au lieu d'un liquide visqueux.

Le gène unc-119 de secours peut être placé soit en cis sur le même plasmide que le transgène ou sur un plasmide séparé qui est mélangé avec le transgène avant enrobage des particules d'or. Alors que le mélange d'un ou plusieurs plasmides est généralement réussie, nous et d'autres ont constaté que le bombardement de vers avec des plasmides multiples peuvent créer des animaux transgéniques portant certains, mais pas tous les plasmides ^6,11. Afin de faciliter plaçant le gène unc-119 sur le transgène plasmide, nous avons récemment décrit un protocole utilisant la recombinaison homologue pour insérer le gène unc-119 dans le gène de résistance à l'ampicilline de presque tous les ¹¹ plasmides.

En outre, pour faciliter le déplacement des transgènes de la souche DP38 en souches ver manque la mutation unc-119, nous avons également généré un plasmide avec unc-119 fusionnée à mCherry ^11. La fluorescence pan-neuronal mCherry peuvent ensuite être utilisés pour suivre la présence du transgène dans une variété de contextes génétiques ^11.

Certains transgènes pourraient être difficiles à détecter après le bombardement à cause de faible expression ou une expression stade spécifique. La présence du transgène peut être vérifié souvent via l'utilisation de la PCR en utilisant les vers transgéniques. Pour transgènes avec faible expression, effectuant des bombardements supplémentaires peuvent conduire à l'identification des lignes à plus forte expression. Alternativement, l'utilisation d'un composé ou microscope confocal peut souvent aider à visualiser l'expression de protéines fluorescentes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold particles	Inbio gold	BD021	1micron
Midiprep kit	Qiagen	12143
Spermidine	Sigma-Aldrich	S4139
Protamine	Sigma-Aldrich	P4505
Macrocarriers	Bio-Rad	165-2335
PDS-1000/He Hepta System	Bio-Rad	165-2257
Rupture disk	Bio-Rad	165-2330
Nystatin	Sigma-Aldrich	N1638
Streptomycin	MP Biomedicals	100556