生成的基因 C。线虫通过基因枪转化

Summary

转基因蠕虫常用

Abstract

使用自由生活线虫C.的实验室的数量线虫是迅速增长。这种生物模型的普及是由于快速的一代人的时间和寿命短，维护容易和便宜，完全测序的基因组，和RNAi的资源和突变的动物数组。此外，分析了C.线虫基因组中发现了蠕虫和高等脊椎动物之间极大的相似性，这表明蠕虫病毒的研究可能是一个重要的辅助手段，在整个小鼠培养细胞进行的研究。一个强大的蠕虫病毒的研究和重要组成部分，是利用转基因动物的研究，基因定位和功能的能力。可以创建可以通过蠕虫生殖显微注射，或通过利用基因枪法转基因动物。炮击是一个较新的技术并不太熟悉的实验室。在这里，我们描述了一个简单的协议生成的Bio - Rad公司PDS - 1000系统使用的金粒子枪法转基因蠕虫。到雌雄同体生殖与DNA显微注射法相比，该协议已经不需要特殊技能，从运营商方面识别蠕虫解剖或执行显微注射​​的优势。通常从一个单一的轰炸进一步多个转基因株系。此外，在对比，以显微注射法，基因枪法染色体外的阵列和集成的转基因与转基因动物。能够获得综合的转基因株系，可避免使用整合外源DNA诱变协议。总之，基因枪法可以代转基因动物的一个极具吸引力的一种方法，尤其是对不感兴趣的投资需要的时间和精力，成为显微注射技术熟练的调查。

Protocol

概述

传统的转基因蠕虫所产生的 C.显微注射到转基因DNA 线虫生殖^1,2,3,4。虽然成功，这种方法需要专门的设备和经验与蠕虫解剖和显微注射技术的发展。最近枪法已发展作为另一种方法，它使用DNA包覆的金颗粒引入外源DNA的生殖^细胞 5,6 。这种方法需要较少的时间在实践方面的投资，成为成功的。

C.枪法线虫生成转基因蠕虫已经在个人蠕虫水平的低效率，所以取得成功，需要大量的动物。这些都可以在几个方面成长，但我们用鸡蛋板，以减少工作和涉及的板块数目。我们的协议，开始准备鸡蛋板和蠕虫，然后集中轰击在Bio - Rad PDS-1000/He七溴系统使用协议。我们调整我们的协议，在工作Berezikov ^等 7的一部分。

随着轰击，UNC - 119基因通常被用作转基因动物的标志。携带这种突变的蠕虫病毒株，严重不协调，勉强移动，矮胖的外观，而且也无法形成的^dauer幼虫8。的dauer是一个备用的幼虫阶段，它是用来延迟在不利条件下，发展生殖成人，和成的dauer项是由^多个基因的9调节。运载UNC - 119基因的几个菌株，可从三线虫遗传学中心（CGC，明尼苏达州明尼阿波利斯）。原DP38株（UNC - 119（ED3））也进行无关的dauer形成构（DAF - C）突变可能影响下游实验。几个实验室有异交这种突变，HT1593应变是从政府总部大楼。我们发现，转基因动物是比较容易识别与DP38应变，并趋向于使用这样的压力下，为创造转基因动物。必要时，我们使用HT1593交配的转基因蠕虫删除DAF - C突变。 DP38蠕虫增长是在协议中最慢的步骤之一，所以我们在保持增长的板块的股票，而准备的转基因。

UNC - 119感兴趣的基因标记的表达式允许易于识别基础上的正常蠕动和车身^尺寸 5救援转基因动物表达。 UNC - 119基因，可从几个来源， 使用UNC - 119基因组DNA的载体，UNC - 119启动子和cDNA和基因组DNA 为较小的C briggsiae基因用于^8,10。最近，我们描述了一个简单的协议中添加一个UNC - 119盒式任何含有氨苄青霉素抗性基因的质粒通过^同源重组11和方法来修改蠕虫fosmids进行CRE - LOX重组的UNC - 119基因产生转^基因动物12。质粒可以从Addgene公司（马萨诸塞州剑桥，）。

虽然在执行单一的轰炸所涉及的努力是重要的，但管理的的，额外的工作，涉及多个单日轰炸是最小的。因此，我们经常集群生产转基因蠕虫，以减少产生每所涉及的工作。

1。蛋盘的准备

突变的UNC - 119蠕虫难以增长，因为他们行动不便，他们往往饿死一个板块的部分，而板块的其他部分仍然包含食品标准NGM板。鸡蛋板厚的食物层允许UNC - 119蠕虫病毒更容易抓取，并接管所有^的板7蛋板解决这个问题。鸡蛋板也有大量的蠕虫病毒的生长，使更少^的板需要13的支持受益。一般5个鸡蛋板足以增长一炮击中的蠕虫病毒。下面的配方使得大约50板，但可减半少，如果需要的话。

鸡蛋板可以成为容易受到污染，所以我们在板使用的抗生素和抗真菌药物，只用次氯酸钠播种板的处理产生的鸡蛋。

第1天：

1. 准备在一个500毫升的瓶子磅（400毫升）。高压灭菌器为20分钟。
2. 倒〜50 10厘米NGA的板使用1公升NGA的2％琼脂。我们每公升和链霉素添加制霉菌素10毫升至200微克/毫升^13。
3. 200μg/ mL链霉素，增长40毫升OP50 - 1 LB培养过夜。这株链霉素抗性和从总部大楼。
4. 高压灭菌器为500毫升一瓶第二天。

第2天：

1. 10个鸡蛋分开蛋黄进入无菌瓶。我们用一个蛋黄分离器（可在家庭商店，包括目标）。摇匀。
2. 将量400毫升用LB。动摇
3. 在60 ° C孵育1小时。
4. 冷却至室温。
5. OP50 - 1添加40毫升。动摇
6. 分发5-8毫升每盘混合。
7. 允许板在室温下静置过夜。

第3天：

1. 从板轻轻倒出剩余的液体。允许干在室温下用盖子上过夜。

第4天：

1. 置于4℃直至所需的板成箱或塑料袋和存储。这些板块出现被确定为1-2个月使用。

2。播种蛋板

1. 加入集中OP50最近饿死板展开6厘米NGA的板DP38蠕虫。对于一个单一的轰炸中，我们用小板〜6种子5个鸡蛋板。对于多个轰炸，我们用小板，而不是种子丰富的蛋白胨2板播种前鸡蛋板。
2. 隔离通过使用次氯酸钠^13,14 DP38蠕虫卵。重悬在无菌的S -基肥或M9缓冲区^13,14鸡蛋。
3. 新增的蛋（每盘> 10,000）鸡蛋板的适当数量。增长20 ° C时为7-10天使用轰击的蠕虫卵板。板块将准备使用一次的蠕虫已经开始明确的食品板块。这些板块确有困难的，饿死和更长的持续时间增长将提高蠕虫产量。

轰击

我们准备的黄金储备时间提前，并保持在4 ° C下使用存储。还需要unspotted，并发现了10厘米NGA的板。 unspotted板需要提前做好浇，让其彻底干燥，以促进吸收与蠕虫添加液体。

在一天的轰击，我们洗掉，然后开始准备的DNA涂层的金颗粒的蠕虫。然后，我们添加的蠕虫unspotted NGA的板，完成洗的金颗粒和他们转移到macrocarriers。

金粒子的制备：

1. 称取60mg金颗粒在1.7mL管和70％的乙醇浸泡15分钟。自旋简要沉淀的金颗粒。
2. 在无菌水清洗3次，每次旋转简要收集黄金。
3. 重悬在50％的无菌甘油1ML的金牌。这是股市的黄金粒子的解决方案，可以存放在4个月为° C。

蠕虫：

1. 关闭的S -基肥或M9缓冲的鸡蛋板浮法DP38蠕虫，并转移至50ml锥形管。
2. 在板凳上的管子，直到蠕虫在底部。然后吸出缓冲区，并添加新鲜的S -基肥或M9。洗2〜3次，直到缓冲区是比较明确的碎片。保持在这一步的蠕虫病毒的DNA涂层，直到完成。
3. 吸离开约2-3毫升每轰击缓冲区的蠕虫。转移至10厘米unspotted NGA的冰板。重要的是最大限度地减少传输量衙前板将需要完全晾干后方可轰击。一定要板的整个表面覆盖的蠕虫。
4. 允许干冰板。冰蠕虫防止结块，同时干燥。

这一步很重要：板应干燥，衙前板均匀分散的蠕虫。上冰蠕虫，阻止他们对板块移动，聚集和成桩。

DNA的制备（之一轰击）：

1. 在一个1.7mL管混合：
   • 50μL的黄金颗粒。之前加入彻底重悬。
   • 50μL的DNA（10 - 15ug）。我们看到圆形或线性DNA之间的差别不大。通常我们使用DNA纯化Qiagen公司midiprep盒（QIAGEN公司，瓦伦西亚，CA）。
   • 50μL2.5M氯化钙_2。这个解决方案是在室温下几个星期的稳定。
   • 20μL0.1M精胺。
     
     亚精胺是在水溶液中不稳定。我们70μl精胺分装并储存于-20 ° C我们再加入1ml到水权使用前获得一个0.1M的解决方案。该解决方案必须准备新鲜的每个轰击。
     
     我们通常在1.7mL管旋涡的金粒子，在低速，然后_添加氯化钙，DNA和亚精胺/鱼精蛋白中滴加而震荡。对于磷酸钙转染的人，这种技术很熟悉。
     
     我们也使用鱼精蛋白，而不是精胺，具有非常好的结果^15。我们准备一个新的解决方案（1mg/ml的）在水和我们Ë50μL，而不是精胺20μL。如果我们用鱼精蛋白的话，我们通常在室温下孵育10分钟，而不是放置在冰上的混合物。鱼精蛋白并不需要冰冻保存，是一种粉末，而不是液体。
2. 孵育30min后在冰的混合物，并定期混合保持悬浮液中的金颗粒。然后简单地旋转和吸出上清液。
3. 300μL70％乙醇洗。自旋简要。
4. 洗涤用1ml 100％乙醇。自旋简要。
5. 悬浮在170μl100％的乙醇。

准备macrocarriers：

1. 冲洗7 macrocarriers（Bio - Rad公司实验室，大力士，CA），2 - 丙醇。放在纸巾上，并让他们在室温下干燥。
2. DNA /金混合物添加在每个macrocarrier中心20μL。之前确定涡权移液，悬浮液中保持的黄金。
3. 让乙醇蒸发。

3。轰击

请务必执行一个空白轰击实验前冲洗氦气通过系统。

1. 真空泵的开启和关闭真空泵陷阱。我们使用无油真空泵。
2. 打开氦气罐。检查压力≥2200psi。
3. 湿破裂盘，在2 - 丙醇（1350 psi）时，放置在保留第七溴适配器。
4. 拧入PDS - 1000系统的适配器，并与所提供的扭矩扳手拧紧。
5. 将7成的持有人，座位他们提供的工具macrocarriers。持有人，然后把一个七溴停止屏幕的底部。从上面的第二个架子上，翻转超过持有和地点。黄金发现一侧macrocarriers必须朝下，在这一点上。
6. macrocarrier持有人的七溴适配器网点顶部的孔对齐。
7. 将衙前板涂轰击室的最低货架上的蠕虫（盖关闭）。
8. PDS - 1000真空流量旋钮完全打开。 VAC按按钮，直到室达到在HG 26。然后切换到保持原来位置，以保持真空。
9. 按住直到磁盘破裂的消防按钮。会发生这种情况，当压力达到1350psi。有时，这需要5-20秒发生。松开按钮。
10. 发行真空室（泄位置），并删除板。
11. 打开真空和氦关闭。
12. 消防几次，直到该行不包含氦（氦压力表应标志0 PSI）。
13. 关闭PDS - 1000系统。

蠕虫轰击后的恢复：

1. 保留在20 ° C下20分钟的轰炸板。
2. 从盘用10 mL的S -基肥或M9缓冲浮动的蠕虫病毒。
3. 0.5ML蠕虫放在20 - 10厘米发现NGA的板块。
4. 保留在20 ° C或室温为2周左右（22-24℃）前检查获救蠕虫。
5. 在解剖显微镜UNC - 119（+）表型的蠕虫的画面。筛查的最佳时间是后板都饿死以来获救的蠕虫非救出蠕虫有生存优势。
6. 各10厘米的板中救出蠕虫生成一个单独的行。

4。代表性的成果

该协议获得转基因动物方面的成功，依赖于特定的基因。发起人：GFP记者转基因，我们获得了20行。一个较为典型的结果是3-10线。高达30％的转基因株系的综合线，但是这是随机的，我们将执行多个单日的轰炸，如果一个集成线路是特别期望。

Discussion

基因枪法是一个简单的的方法，引入外源DNA的许多生物，包括 C。 线虫 ^{1,5,6,7,16。}依靠黄金颗粒，形成了一个复杂的DNA _与氯化钙存在。阳离子多胺，如亚精胺，保护核酸在体内降解的DNA。既然精胺是一种不稳定的分子，它是重要的存储在小分装于-20 ° C，并在执行轰击之前做出正确的解决方案。正如我们在轰炸协议描述，鱼精蛋白可以用来代替亚精胺提供外源DNA ^15。鱼精蛋白的优势在于更加稳定，在室温和粉，而不是一种粘性液体。

UNC - 119救援基因可以被放置在独联体国家，在相同的转基因质粒或在一个单独的质粒是与转基因混合之前，涂层的金颗粒。当一个或多个质粒的混合，通常是成功的，我们和其他人发现，轰炸蠕虫具有多个质粒可以携带一些转基因动物，但不是所有^的质粒6,11。为了便于放置在UNC - 119基因的转基因质粒，我们最近描述了一种使用几乎所有的质粒¹¹氨苄青霉素抗性基因插入到UNC - 119基因同源重组的协议。

此外，为方便从DP38成蠕虫病毒株缺乏UNC - 119突变株转基因，我们也产生了与UNC - 119质粒融合mCherry ^11。泛神经mCherry荧光可以被用来跟踪的基因在¹¹多种遗传背景的存在。

轰击后，由于弱表达或一个阶段的具体体现，有些转基因可能是难以察觉。往往通过使用转基因蠕虫使用的PCR基因的存在，可以验证。对于弱表达外源基因，执行额外的轰炸导致的行具有较强的表达的识别。另外，化合物或共聚焦显微镜的使用往往可以帮助可视化荧光蛋白的表达。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold particles	Inbio gold	BD021	1micron
Midiprep kit	Qiagen	12143
Spermidine	Sigma-Aldrich	S4139
Protamine	Sigma-Aldrich	P4505
Macrocarriers	Bio-Rad	165-2335
PDS-1000/He Hepta System	Bio-Rad	165-2257
Rupture disk	Bio-Rad	165-2330
Nystatin	Sigma-Aldrich	N1638
Streptomycin	MP Biomedicals	100556