Summary
Die Transplantation von isolierten Inseln wurde vorgeschlagen, eine potenzielle Behandlungsoption für Typ-1-Diabetes sein. Hier beschreiben wir eine Methode, um kleine Inseln aus Maus Bauchspeicheldrüsen zu isolieren und verpflanzen sie in die subkapsulären Raum der Niere.
Abstract
Seit den frühen Pionierarbeiten von Ballinger und Reckard zeigen, dass die Transplantation von Langerhans-Inseln in diabetischen Nagern ihren Blutzuckerspiegel zu normalisieren könnte, hat Inseltransplantation vorgeschlagen worden, eine mögliche Behandlung für Diabetes Typ 1 1,2 sein. In jüngerer Zeit haben Fortschritte in der menschlichen Inseltransplantation weitere dieser Ansicht 1,3 gestärkt. Allerdings verhindern, dass zwei wesentliche Einschränkungen Inseltransplantation von einem breiten klinischen Realität: (a) die Voraussetzung für eine große Anzahl von Inseln pro Patient, die eine erhebliche Verringerung der Zahl der potenziellen Empfänger und (b) die Notwendigkeit für schwere Immunsuppression, die erheblich beeinträchtigt der pädiatrischen Population von Patienten aufgrund ihrer Anfälligkeit für langfristige Immunsuppression. Strategien, die diese Einschränkungen zu überwinden haben das Potenzial, den therapeutischen Nutzen von Inseltransplantation verbessern.
Inseltransplantation unter der Maus Nierenkapsel ist ein weithin akzeptiertes Modell, um verschiedene Strategien zu untersuchen, um Inseltransplantation verbessern. Dieses Experiment erfordert die Isolierung von hoher Qualität Inselchen und Implantation von kleinen Inseln, die diabetische Empfänger. Beide Verfahren erfordern chirurgische Schritte, die besser durch Video werden als durch Text nachgewiesen. Hier dokumentieren wir die einzelnen Schritte für diese Verfahren durch Video-und schriftlichen Protokoll. Wir haben auch kurz auf verschiedene Modelle Transplantation: syngenen, allogenen, syngenen autoimmune und allogenen autoimmune.
Protocol
1. Vorbereitung und Kalibrierung von Liberase Reagent
- Dieses Protokoll nutzt Liberase TL (Roche, Kat. Nr. 05 401 020 001) Enzym der Bauchspeicheldrüse Verdauung.
- Purchase 100-200mg zu einer Zeit und machen einen großen Stapel. Re-suspend lyophilisierten Pulvers in sterile HPLC Wasser, so dass die Konzentration etwa 26 Wünsch-Einheiten pro ml ist. Dieser sollte ca. 5 mg / ml sein. Siehe die Packungsbeilage für weitere Einzelheiten über die Wünsch-Einheiten in der spezifischen Menge enthalten sind. Legen Fläschchen auf Eis für 30 Minuten mit gentile wirbelnden alle paar Minuten. Stellen Sie sicher, Pulver vollständig am Ende der 30 Minuten aufgelöst.
- Pool alle gelösten Liberase zusammen und vermischen sich mit leichtem Schwenken (nicht vortexen oder schütteln). Aliquot 24,3 Wünsch Einheiten vorgekühlte Eppendorph Rohre, quick freeze auf flüssigem Stickstoff (behandeln sie wie alle Enzyme) und bei -80 ° C. Dies sollte etwa 0.935ml pro Eppendorph Röhre. Jedes Aliquot ist zum einmaligen Gebrauch (ausreichend für 11 Mäuse) und sollte nicht gespeichert oder wieder eingefroren einmal aufgetaut werden. Im Allgemeinen ist der Bestand für mindestens 6 Monate lagerfähig.
- Für jede neue Charge, kalibrieren Sie die optimale Inkubationszeit. Verwenden Sie die gefrorenen Lager, nicht die frisch gelöst Lager, zur Kalibrierung, um die realen experimentellen Bedingungen so weit wie möglich zu imitieren.
- Kalibrieren Sie das Wasserbad, das man auf genau 37 verwenden möchten ° C mit einem Quecksilber-Thermometer. Verwenden Sie den gleichen Inkubator in zukünftigen Experimenten.
- Vor dem Gebrauch auftauen eine Tube Liberase auf Eis und fügen Sie ihn (0.935ml) zu 21.6ml serumfreien RPMI, was eine abschließende Arbeitskonzentration 1,08 Wünsch-Einheiten pro ml. Serum, BAS und EDTA hemmen Liberase. Zink und Kalzium sind Cofaktoren. Auf Eis und innerhalb von 1,5 Stunden. Dies reicht für ca. 11 Mäuse (2ml/mouse).
- Siehe Schritt 2.3 für Pankreas-Perfusion. Perfundieren so viele Mäuse wie möglich in 1 Stunde. Dann nutzen Sie eine oder zwei Mäuse für jeden Inkubationszeit und testen Sie 10, 12, 14, 16, 18 Minuten Inkubationszeit. Wenn möglich, sind 30 Sekunden-Intervallen zwischen den Zeiten, als der Zeitpunkt der Verdauung sehr wichtig ist.
- Füllen Sie das Inselchen Isolation Protokoll und analysieren Insel Ertrag und Qualität von jedem Inkubationszeit Punkt. Letztendlich ist die Rendite sollte nicht zu viel Wechsel zwischen Stoßzeiten, sondern die Qualität der Inseln an jene Intervalle können variieren. Für nachfolgende Versuche, die Bedingungen, die sich in der größten Anzahl von Inseln, die gesunde 48 Stunden nach der Isolierung sind. Das Alter der Mäuse scheint die optimale Inkubationszeit beeinflussen. Also, nutzen Mäuse in einem ähnlichen Alter Bereich. Im Idealfall verwenden 8-12 Wochen alte Mäuse, aber auch 8-10 Monate alten Mäusen können gute Inseln zu erhalten. Für die Kalibrierung Zwecke verwenden jüngeren Mäusen.
2. Surgical Procedure
- Bereiten Sie alle Geräte und Medien vor euthanizing der Insel Spender-Mäusen.
- Autoklaven oder Flamme sterilisieren Instrumente vor Gebrauch. Alle Reagenzien und Instrumente (Berühren der Proben) sollten steril sein. Die Isolierung und Handlese der Inseln kann außerhalb eines Laminarströmungshaube ohne eine starke Erhöhung der Inzidenz von Verunreinigungen durchgeführt werden. Allerdings ist die Sterilisation von Instrumenten, die in Kontakt mit der Bauchspeicheldrüse oder Inseln kritisch zur Vermeidung von Kontaminationen. Folgende Werkzeuge werden benötigt:
- 1 Paar Präparierscheren für Bauchschnitt.
- 2 Paar Zangen.
- 1 hämostatischen Zange zum Spannen Sie den Gallengang.
- 0,419 mm Durchmesser Drahtgeflecht.
- 0,1 mm Durchmesser Nylon-Mesh.
- Biegen Sie mehrere 27-Gauge-Nadeln, so dass eine 70-Grad-Winkel etwa auf halbem Weg ist über die gesamte Länge der Nadel eingeführt. Die abgeschrägte Kante der Nadel sollte nach der Innenseite der Ellenbogen.
- Füllen Sie eine Sprühflasche mit 70% Ethanol.
- Richten Sie ein Binokular mit einer ausreichenden Lichtquelle auf einem Labortisch oder in eine Kapuze.
- Pre-chill-Zentrifuge auf 4 ° C. Zentrifuge muss eine Schaukel Eimer Rotor, in der Lage sein 900xG, gekühlt werden, und haben eine Pause, die gelöst werden können. Auf einer Sorvall mit der Sorvall H1000B Rotor RT6000D, ist ein 900xG Geschwindigkeit 2400rpm. Langsamere Spins bei 800RPM getan.
- Legen Sie die folgenden Reagenzien auf Eis.
- RPMI (1 Liter mit 10% Serum)
- RPMI (200ml ohne Serum)
- 50ml konische Röhrchen (1 für jede Bauchspeicheldrüse)
- 5ml-Spritze.
- Äquilibrieren Histopaque1077 auf Raumtempetemperatur.
- Thaw einmaligem Gebrauch Aliquot kalibriert Liberase auf Eis und verdünnter in 22.5ml serumfreien RPMI. Serum, BAS und EDTA hemmen Liberase. Zink und Kalzium sind Cofaktoren. Auf Eis und innerhalb von 1,5 Stunden. Dies reicht für ca. 11 Mäuse (2ml/mouse).
- Warm 37 ° C Wasserbad.
- Zur Hand haben, wie viele Mäuse wie Sie in 1 Stunde (ca. 10 bis 18 Mäuse) können kanülieren.
- Autoklaven oder Flamme sterilisieren Instrumente vor Gebrauch. Alle Reagenzien und Instrumente (Berühren der Proben) sollten steril sein. Die Isolierung und Handlese der Inseln kann außerhalb eines Laminarströmungshaube ohne eine starke Erhöhung der Inzidenz von Verunreinigungen durchgeführt werden. Allerdings ist die Sterilisation von Instrumenten, die in Kontakt mit der Bauchspeicheldrüse oder Inseln kritisch zur Vermeidung von Kontaminationen. Folgende Werkzeuge werden benötigt:
- Bereiten Sie mit der Maus zur Kanülierung. Erste euthanize der Maus durch Genickbruch oder CO 2 Ersticken. Während Maus abläuft, füllen Sie die 5ml Spritze mit 2ml Liberase arbeiten Aktie (1,08 Wünsch Einheiten / ml).
- Bewegen Sie die Maus in Rückenlage auf einem Papiertuch am Binokular und sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol vor dem Öffnen des Bauches mit einem V-Schnitt von der Schamgegend, beide Vorderbeine. Falten Haut über der Brust in die Bauchhöhle zu offenbaren.
- Bewegen Sie die Maus mit dem Kopf zeigt auf Sie. Suchen Sie den Zwölffingerdarm Eingabe des Choledochus, wie in Abb.1 hervorgehoben. Dies kann, ohne durch Binokular Ziel durchgeführt werden.
- Klemmen Sie den Zwölffingerdarm Öffnung mit hemostat wie in 2 gezeigt. Clamp Position ist entscheidend für das Blockieren des Liberase in den Darm. Wenn Klammer ist zu hoch oder zu niedrig ist, wird Liberase nicht perfuse der Bauchspeicheldrüse. Position hemostat, so dass, wenn sie zusammengedrückt, läuft es genau entlang der Bauchspeicheldrüse / Darm Grenze.
- Vor cannulating den gemeinsamen Gallengang, kann es notwendig sein, um die Leber, indem sie sich gegen das Zwerchfell, so dass die gesamte Länge des Choledochus ausgesetzt ist (Abb. 3) neu zu positionieren. Sobald die Länge der Gallengang ausgesetzt, die gebogen 27-gague Nadel an der Liberase Fertigspritze zur Kanülierung. Es gibt zwei Techniken für cannulating den Gallengang.
- Bei der ersten Technik, oder "freie Hand"-Methode eingespannte hemostat auf den Zwölffingerdarm weg von der Spitze der Maus auf den Schwanz gezogen, so dass der Choledochus wird straff. Es ist ein Zusammenfluss in den Gallengang in der Nähe der Leber, wo Galle Ablassen aus der Gallenblase und Enzyme aus der Leber zusammen, bevor sie den Darm kommen. Das Innere des V von diesem Zusammenfluss gebildet wird, indem Sie den Gallengang eng ausgesetzt und ist ein idealer Ort, um Kanülierung des Kanals (Fig. 4) zu initiieren. Wenn richtig positioniert ist, wird die Nadel rechts gleiten durch die V, und direkt kanülieren der untere Teil des Kanals. Führen Sie die Nadel einige Millimeter in den Kanal vor der Abgabe der Liberase. Optimal Nadel Platzierung ist wichtig, um den Rückfluss in die Leber und Gallenblase zu verhindern. Darüber hinaus ist es wichtig, dass die Nadel nicht so weit, dass es die Milz Kanal behindert eingefügt werden. Die Milz Kanal ist ein schwierig zu Zweig des Choledochus zu sehen und es fließt der Milz Schwanz der Bauchspeicheldrüse, einer kleinen Insel reiche Gegend. Wenn die Nadel gleitet vorbei an der Öffnung für die Milz Kanal, wird es weniger als die vollständige Durchblutung der Milz Schwanz und möglicherweise reduziert Verdauung dieser Gegend. Optimal Insel Ertrag tritt auf, wenn Ihr Nadeltiefe weit genug, dass keine Liberase der Leber / Galle entweicht aber nicht so weit, dass Sie die Milz Kanal geleitet wird. Sie können für eine erfolgreiche Kanülierung durch den Verzicht auf eine kleine Menge Liberase testen. Wenn Sie die Liberase Füllung des Kanals sehen, dann verzichten Rest der 2mls. Wenn das Gebiet um den Kanal zu füllen beginnt, stoppen Dosieren, positionieren Sie die Nadel, und versuchen Sie es erneut.
- Bei der zweiten Technik, oder 'Pinzette helfen "-Methode eingespannte hemostat auf den Zwölffingerdarm weg von der Spitze der Maus auf den Schwanz gezogen, so dass der Choledochus wird straff. Dann, mit dem gebogenen 27-gague Nadel auf die Spritze 5ml befestigt, Punktion der Faszie unter dem gemeinsamen Gallengang in der Nähe der Leber. Verwenden Sie die Nadel auf der Faszie aus dem Kanal (Abb. 5) deutlich. Mit der Nadel noch an seinem Platz, setzen Sie die hemostat nach unten und holen eine Zange. Verwenden Sie einen Arm des offenen Zangen zum Anheben der Gallengang, wo die Nadel der Faszie gelöscht wurde. Die Stege in die Zange zu schaffen ein Traktat, mit dem Sie die Nadel in den Kanal führen kann. Während Sie den Kanal-und Pinzette zu Ihnen, schieben die Nadel in den Kanal mit der Zange als Rücklaufsperre. Test für Kanülierung durch den Verzicht auf eine kleine Menge Liberase. Wenn der Kanal zu füllen beginnt (Abb. 5 Pfeil), verzichten Rest der 2mls. Wenn das Gebiet um den Kanal zu füllen beginnt, stoppen Dosieren, positionieren Sie die Nadel und versuchen Sie es erneut.
- Als 2mls von Liberase füllt die Bauchspeicheldrüse, die in der Nähe des Duodenums beginnt zu expandieren, gefolgt von der Region auf dem Bauch, und schließlich die Milz Schwanz (Abb. 6). Schauen Sie selbst für Ausbau der Bauchspeicheldrüse (ABB.6). Wenn ein Bereich beginnt zu expandieren und Sie nicht sehen, das weiße Gewebe gleichmäßig erweitern und zu verbreiten, ist es wahrscheinlich, dass die gemeinsamen Gallengang wurde nicht durchbohrt, noch die Nadel im Inneren des Pankreas Kapsel. Befüllen der Kapsel mit Liberase wird nicht in einer hohen Insel Ertrag Ergebnis als die Oberfläche ausgesetzt, um das Enzym wird als gering eingeschätzt. Wenn dies geschieht, stoppen Perfusion und Neupositionierung der Nadel.
- Sobald die Bauchspeicheldrüse durchblutet ist, kann sie von der Maus, indem Sie sie frei von den Berührungspunkten mit dem Darm, Magen und Milz entfernt werden. Starten Sie, indem Sie die hemostat aus dem Zwölffingerdarm. Dann verwenden Sie die Zange in den Zwölffingerdarm Aufzug und trennen die Bauchspeicheldrüse aus dem Darm mit einer zweiten Pinzette (Abb. 7a-B). Dies wird durch Halten des zweiten Pinzette stetig, während Sie den Darm aus dem Bauch gemacht. Als nächstes ziehen die Bauchspeicheldrüse frei von der Oberseite des Magens und der Milz (Abb. 7c-D). Schließlich heben die Bauchspeicheldrüse aus dem Bauch und schneiden Sie es kostenlos von der restlichen Faszie Verbindungen (FIG.7E-F).
- Legen Sie die Bauchspeicheldrüse in einem 50ml konischen Rohr und lassen Sie ihn auf Eis während der Arbeit an den anderen Mäusen. Starten Sie eine 1-Stunden-Zeitschaltuhr. Für maximalen Ertrag Insel, Ort, nur 1 Bauchspeicheldrüse in jeder Röhre. Es ist nicht empfehlenswert, die perfundierten Pankreata auf Eis mehr als 1 Stunde zu verlassen, da die Liberase beginnen, das Gewebe abbauen. Am Ende der Stunde, sofort in eine 3,0 für alle Bauchspeicheldrüsen, dass waren perfundiert Schritt.
- Wiederholen Sie die Schritte 2,3 bis 2,6 für die restlichen Mäuse oder bis die 1 Stunde Timer gestartet in Schritt 2.6 abgelaufen ist.
3. Purifying Inseln aus der perfundierten Pankreata
- Vor den Inseln der Bauchspeicheldrüse gereinigt werden können, das Gewebe muss bei 37 ° C verdaut werden Gruppe der 50 ml Röhrchen mit dem perfundierten Inselchen in einem offenen Boden-Rack, in das 37 ° C Wasserbad passt. Stellen Sie sicher, dass alle Verschlüsse gut befestigt sind und tauchen Rohre im 37 ° C Wasserbad für die exakte Menge an Zeit für die aktuelle Charge von Liberase vorgegeben (siehe Schritt 1.4). Am Ende der Inkubationszeit, bewegen Sie den Rohren zu Eis und fügen RPMI1640 mit 10% Serum 20mls pro Röhre. Serum-haltigen Medien stoppt die Liberase Verdauung.
- Trennen Sie die Gewebe durch Schütteln der Röhrchen kräftig 40-mal in 10 Sekunden. Dieser Schritt ist wichtig für die optimale Verwertung von Inselchen. Selbst bei optimaler Liberase Perfusion und genau kalibrierten Verdauung Zeit wird Inselchen Ertrag niedrig sein, wenn das Gewebe nicht aufgebrochen wird. Die aggressive Handhabung der Proben in diesem Schritt scheint nicht mit der Maus Inseln schaden und es ist notwendig, um sie von exokrinen Zellhaufen frei.
- Zur Trennung der Inseln aus der verdauten Bauchspeicheldrüse, die folgenden Schritte aus.
- Pool verdaut Pankreata so dass es etwa 2,5 Bauchspeicheldrüsen pro Röhrchen werden. Dabei werden zehn Rohre bis 4 Röhren mit 50mls von Medien jeder kondensiert werden.
- Zentrifugenröhrchen für 2 Minuten bei 800RPM und 4 ° C.
- Abgießen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 15-25mls Medien mit 10% FBS durch Vortexen sanft (Anpassung Wirbel Intensität auf ca. 50% des Maximums) für mehrere Sekunden.
- Gießen Sie den resuspendierten Schlamm durch die 0.419mm Drahtgeflecht und Trichter in ein frisches 50ml konischen Rohr. Diese trennt den nicht-verdaute Gewebe, Fett und Lymphe. Spülen Sie die erste Röhre mit einem zusätzlichen 10mls von Medien mit 10% FBS und gießen Sie durch das Drahtgeflecht. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Röhren.
- Zentrifugieren für 2 Minuten bei 800RPM und 4 ° C.
- Abgießen des Überstandes und sorgfältig invertieren die Rohre auf einem Papiertuch. Beobachten, um sicherzustellen, dass die Inseln nicht abrutschen. Wischen Sie die Innenseite der Rohre mit einem Papiertuch, um restliches Medium zu entfernen, darauf achten, daß das Zellpellet zu stören. Zurück Rohre in eine aufrechte Position.
- Resuspendieren der Pellets in 5mls der Raumtemperatur histopaque1077 durch Vortexen sanft für mehrere Sekunden. Stellen Sie sicher, dass die Aussetzung homogen ist, bevor Sie einen zusätzlichen 5mls Histopaque um die Innenseite des Rohres. Dies spült die Inseln vor der Wand des Rohres.
- Overlay HISTOPAQUE mit 10mls von serumfreien RPMI, wobei darauf zu einer scharfen Grenzfläche zwischen dem HISTOPAQUE und Medien zu erhalten. Fügen Sie die Medien durch Pipettieren langsam die Seite des Rohres mit einer Rate von 1 ml pro 10 Sekunden. Die Medien sollten auf der Oberseite, und HISTOPAQUE auf der Unterseite. Serum wirkt sich auf die Dichte der Medien und sollte nicht bei diesem Schritt verwendet werden.
- Spin-Proben in einer Zentrifuge äquilibriert bis 20 ° C bei 2400rpm (900xG) für 20 Minuten mit sehr langsame Beschleunigung und keine Bremsen. Dieser Schritt trennt die Inseln aus dem exokrinen Zellen. Die Inseln werden auf die Schnittstelle zwischen dem Serum-freien Medien und Histopaque migrieren, während der exokrinen Zellen will bilden eine Pellet am Boden des Röhrchens.
- Sammeln Sie die kleinen Inseln von der HISTOPAQUE / media-Schnittstelle mit einem Einweg-10ml serologischen Pipette. Islets wird auf Glas-Stick, daher Glaspipetten sollte nicht verwendet werden, sofern sie nicht silikonisiert worden sein. Legen Inseln in ein frisches 50ml konischen Rohr. Mehrere Rohre können an dieser Stelle gebündelt werden. Füllen Sie das Röhrchen 50ml mit Serum mit RPMI.
- Zentrifugenröhrchen für 2 Minuten bei 800RPM und 4 ° C.
- Abgießen des Überstandes und Resuspendieren der Inseln in 50mls von Serum mit RPMI durch Vortexen sanft.
- Zentrifugieren für 90 Sekunden bei 800RPM und 4 ° C.
- Abgießen des Überstandes und das Waschen wiederholen 1 mehr Zeit.
- Abgießen des Überstandes und nehmen Röhren der Gewebekultur Kapuze. Add Pen / Strep zu RPMI mit 10% FBS auf eine Endkonzentration von 1% auf der Insel Kulturmedien zu machen. Resuspendieren Inselchen in 5mls dieser Kultur Medien.
- Schwenken 0.1mm Nylon Zellsieb und legen Sie es auf einem 15 ml konische Röhre. Langsam gehen die resuspendierten Insel Aufschlämmung durch das Sieb. Die Inseln werden von den Sieb zurückgehalten werden, während der exokrinen Zellen durchlaufen in den 15 ml konische Röhre. Dieser Schritt erhöht drastisch die Reinheit der Inseln im Hinblick auf exokrinen Zellen Kontamination am Ende des Protokolls.
- Spülen Sie die 50ml konischen Rohr mit einem zusätzlichen 6mls von Medien und Pipette es durch das Sieb.
- Legen Sie 3mls von Kulturmedien wie ein großer Tropfen in einem 10-cm-Petrischale. Kehren Sie die Zellsieb rechten Seite nach oben, so dass die Oberfläche verwendet werden, um die Inseln zu erfassen in den Medien fallen kann getaucht werden. Berühren Sie den Filter in den Medien werden die meisten der kleinen Inseln in eine nicht-Gewebekultur behandelt Petrischale übertragen. Mit einer nicht behandelten Petrischale ist entscheidend für die Insel Adhäsion und Ausbreitung auf der Oberfläche der Platte zu vermeiden. Frei schwebende Inseln sind viel leichter für die Trennung in experimentellen Gruppen aufgegriffen.
- Pipette eine zusätzliche 5-7mls von Kulturmedien durch das Sieb in die Petrischale, um restliche Inseln abwaschen der Sieb in die Schüssel.
- Überprüfen Sie die Insel Ertrag und die Qualität in einem 4-fach Objektiv auf einem inversen Mikroskop. Wirbelnde das Gericht in einem engen Oval wird das Inselchen in der Mitte der Schale zu sammeln. Wenn die Inseln gut aussehen, können sie entweder sofort zu Versuchszwecken verwendet abgeholt werden oder gleichmäßig auf 4-6 10cm Petrischalen (je 10 Mäuse) getrennt. Die Kultivierung zu viele Inseln in das gleiche Gericht bewirkt, dass die Inseln zu nekrotisch und degradieren. Für Experimente, tut 250-300 Inseln pro 6cm Schale mit 2-3mls von Medien offenbar nicht die kleinen Inseln Stress.
- Es wird einige brauchbare Inselchen in der 15 ml konische Röhrchen, dass die 0,1 mm Nylon Zellsieb Durchströmung gesammelt werden. Diese Inseln können folgende drei vor vier Runden Schwerkraftsedimentation wiederhergestellt werden. Nach ca. 4 Minuten von Sedimentation, alle absaugen, sondern ca. 1 ml Medium aus dem Rohr und füllen es bis zum Rand mit Kulturmedien. Cap das Rohr und drehen sich zu mischen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals beseitigt viele der einzelnen Zelle exokrinen Zellen, die langsam in das Sediment, und bereichert die schwereren Aggregate von endokrinen Zellen (Inselchen), die schnell sinken. Nach der letzten Aspiration in 7mls von Kulturmedien und Platte in eine frische Petrischale resuspendieren.
4. Arbeiten mit isolierten Inseln
- Der Prozess der Isolierung ist ziemlich stressig auf den Inseln; HISTOPAQUE ist giftig, Schütteln und Zentrifugieren Schritte veranlassen schiere Stress, und die Entfernung vom Host Blutversorgung sowie in-vitro-Kultur induzieren können Hypoxie. Wir und andere haben gezeigt, dass Isolation beta-Zelltod 4-5 induziert. Die Wirkung von diesen Belastungen wird durch die Ablösung von Zellen aus der Peripherie der Insel und der Verdunkelung und Vertreibung der zentrale Kern der Insel (zentrale Nekrose) zu sehen. Während die Ablösung von Zellen aus der Peripherie toleriert werden kann, disqualifiziert die zentrale Nekrose der Insel ist für den Einsatz in Experimenten. In der Regel, je größer die Insel, desto größer ist die Chance, dass eine zentrale Nekrose wird ein Problem sein. Anstrengungen zur Reduzierung der Insel ist nach Isolierung Stressreaktion Ziel erhöht sich die Ausbeute an verwertbarem Inselchen.
- Deshalb verwenden wir eine bereits berichtet Technik der Inkubation der Inseln in einem 22-27 ° C Gewebekultur-Inkubator für die ersten 48-72 Stunden nach der Isolierung 6-8. Diese reduzierte Temperatur dämpft die Inseln Stressantwort und glättet den Übergang zu In-vitro-Kultur. Wenn ein 22-27 ° C Gewebekultur-Inkubator zur Verfügung steht, ist es möglich, den gewünschten Temperaturbereich, in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator durch Abschalten der Wärme-Steuerung und Platzierung ca. £ 20 der ErreichungGefrierschrank Ziegel äquilibriert bis -80 ° C. Dies führt in etwa 16-24 Stunden von reduzierter Temperatur im Inkubator. Ersetzen Sie die -80 ° C Gefrierschrank Ziegel, wie gebraucht. Wir haben nicht einen zusätzlichen Nutzen aus der Inkubation bei dieser niedrigeren Temperatur länger als 72 Stunden beobachtet.
- Neben der niedrigen Temperatur der Inkubation, empfehlen wir den Wechsel der Datenträger 24-48 Stunden nach der Isolierung. Sekretierten Faktoren von Stress und tote Inseln reichern sich in den Medien nach der Isolierung und können zusätzliche Insel Stress fördern. So ändern Sie die Medien, die folgenden Schritte aus.
- Übertragen Sie die Medien und Inselchen aus der Petrischale zu einer 15 ml konische Röhrchen mit einem Kunststoff-Pipette.
- Waschen Sie die Platte mit einem zusätzlichen 3mls von Kulturmedien, um restliche Inseln zu sammeln.
- Fügen Sie diese zusätzlichen 3mls die 15 ml konische Röhrchen und ermöglichen Inseln der Schwerkraft Sediment für 5min.
- Saugen Sie alle aber 1ml Medium aus dem 15 ml konische Röhrchen, dann resuspendieren die Inseln in 4mls der Insel Kulturmedien.
- Übertragen Sie die Inseln und Medien, um eine frische Petrischale. Hinzufügen eines zusätzlichen 3mls von Nährmedien in die 15 ml konische Röhrchen, um restliche Inseln sammeln und fügen Sie diese auf die Petrischale.
- Ändern Sie die Insel Medien jeder drei vor fünf Tagen danach.
- Bei der Kommissionierung Inselchen für ein Experiment, ist es nicht empfehlenswert, Inselchen aus verschiedenen Isolierungen mischen. Die molekulare Grundlinie der Inseln wird von vielen Dingen beeinflusst, darunter die Höhe der Zeit, die sie in Kultur gewesen sein und die Isolation betonen, dass aus prep prep variiert. Zur Reduzierung der Variabilität, muss Inselchen Experimente auf kleinen Inseln, die zur gleichen Zeit isoliert durchgeführt werden. Allerdings, wenn dies nicht möglich ist, empfehlen wir dringend die Bündelung aller Inseln zu einer einzigen Gruppe vor, sie zu sammeln für Experimente. Zur Aufnahme Inselchen für Experimente, die folgenden Schritte aus.
- Wenn Inselchen sind in mehr als ein Gericht, Pool alle Inseln Inkubation in einem einzigen Gericht durch die folgenden Schritte 4.3.1 bis 4.3.5 oben aufgeführt sind. Wenn mehrere Gerichte der Inseln beteiligt sind, sollte ein 50ml konischen Rohr anstelle der 15ml Tube verwendet werden. Dies kann die Variabilität durch feine Unterschiede in Kultur Bedingungen zwischen den Platten während der post-Isolierung Erholungsphase induziert.
- Während die Schwerkraft Sediment der Inseln, Einrichten eines inversen Mikroskops mit einem 4x-oder 10-fach Objektiv ausgestattet. Sammle p200 Mikropipette und eine Schachtel mit sterilen p200 Tipps.
- Übertragen Sie die sedimentierten Inseln zu einer einzigen Platte und bewegen Sie die Platte mit dem Mikroskop. Schwenken Sie die Platte auf den Inseln in der Mitte sammeln. Entfernen Sie den Deckel auf die Platte und die p200-Pipette auf gesunde Inseln holen. Gesunde Inseln haben eine glatte Boarder und keine dunklen Zentrum Regionen (Abbildung 8). Versuchen Sie, eine gleichmäßige Verteilung der Insel Größen im gesamten experimentellen Speisen halten wie Inselchen Größe des Ansprechens auf die Behandlung verändern kann.
- Die Zahl der Inseln pro Versuchsgruppe kann auf die Bedürfnisse des Experiments variieren. Wir schätzen, dass ein Inselchen etwa 1000-2000 Zellen hat und 0,3-1 g Eiweiß und 25ng Gesamt-RNA zu erhalten. Für in-vitro-Assays können eine typische experimentelle Gruppe werden zwischen 100 und 250 Inselchen vergoldet in 35 mm oder 6 cm Schalen mit 1-3ml der Medien. Für die Transplantation wird jeder Empfänger Maus benötigen zwischen 150 und 400 Inseln in Abhängigkeit von der experimentellen Design (Siehe Schritt 5.2.2 und Diskussion für weitere Details).
- Zur Minimierung der Abweichungen von der Hand Kommissionierung eingeführt, verwenden wir die Öffnung der p200-Pipettenspitze als Leitfaden für die Insel Größe zu schätzen. Die meisten Inseln haben einen Durchmesser etwa die Hälfte der Düsendurchmesser, und wir rechnen jeden von ihnen als eine Standard-Insel. Alle Inseln größer oder kleiner als das, ordnen wir eine andere Insel zählen entsprechend. Wir sammeln Inselchen in Chargen von 20-50 und übergeben sie an den bezeichneten experimentellen Küche. Wenn die p200-Pipette auf das Volumen von 180 Mikroliter eingestellt ist, kann man mehrere Inseln (in der Regel mehr als 50 Inseln) zu einer Spitze zu sammeln. So, obwohl die Inseln ein zu einer Zeit geerntet, kann man viele kleine Inseln innerhalb jeder p200-Spitze zu sammeln, indem die Pipetman Auslösemechanismus. Dies erleichtert die Kommissionierung von Hunderten oder sogar mehr als tausend Inseln für Experimente benötigt. Wir nutzen diese chargenweise Betrieb um dazu beizutragen, die Verteilung der Inseln mit ähnlicher Qualität und Größe.
5. Subkapsulären Kidney Inseltransplantation
- Induce Diabetes in Transplantatempfängers Mäusen.
- Legen Mäuse auf einem 4 bis 6 Stunde schnell. Optimal Transplantationspatienten sollte zwischen 6 bis 10 Wochen alt und wiegen 20 bis 25 Gramm zum Zeitpunkt der schnell. Um schnell die Mäuse, entfernen Sie die Lebensmittel aus dem feeding Rack und immer den Mäusen in einem frischen Käfig. Dies gewährleistet eine wahre Fasten durch die Trennung Mäuse aus allen verbleibenden Bits von Lebensmitteln, die zuvor in ihrem Käfig gefallen könnte. Plan für 80% bis 90% der Mäuse zu werden Diabetiker.
- Drei Stunden in der schnellen, bereiten die Natriumcitratpuffer. Abwiegen 0.735g des Enzyms grade Natriumcitrat (Na-Citrat, Herr 294,10 g / mol) und löst ihn in 25mls von sterilem, deionisiertem Wasser. Den pH-Wert auf 4,5 mit HCl. Dieser Puffer sollte frisch für jede Runde von Experimenten sein.
- Legen 0.05g Streptozotocin (STZ, M r 265,2 g / mol) in eine 1,5 ml Eppendorph Röhre. Dieser Betrag reicht aus, um Diabetes in ca. 8 Mäusen zu induzieren. Bereiten Sie eine ausreichende Anzahl von 1,5 ml Röhrchen für die Anzahl der Mäuse injiziert werden. STZ ist lichtempfindlich, so decken jedes Röhrchen mit Alufolie abdecken.
- Nach 4 Stunden schnell, resuspendieren eine Tube STZ mit 1 ml frisch zubereiteten Na Buffer Citrat. Sobald resuspendiert, verliert der STZ-Na-Citrat-Lösung Aktivität innerhalb von 15 bis 20 Minuten, so dass dieser Schritt sollte erst unmittelbar vor der Injektion den Mäusen durchgeführt werden.
- Inject jeder Maus intraperitoneal eine geeignete Volumen des STZ-Na-Citrat-Lösung, um eine endgültige Dosis von 190mg/kg Maus zu erreichen. Diese Dosis kann durch den Stamm und Alter der Maus variieren, daher kann es erforderlich sein, um eine Dosis-Optimierung durchführen, wenn die Inzidenz von Diabetes zu niedrig ist oder wenn zu viele Mäuse in die 3-5 Tage nach der Injektion sterben. Gemeinsame Dosen reichen von 150mg/kg Maus 250mg/kg Maus.
- Versorgung Nahrung und Wasser, wenn alle Mäuse injiziert wurden.
- Test-Mäusen für Nicht-Nüchtern-Hyperglykämie (> 350mg/kg) 2 bis 4 Tage nach der Injektion. Mäuse, die 3 aufeinander folgenden Tagen von Nicht-Nüchtern-Hyperglykämie nachweisen kann als Transplantationspatienten eingesetzt werden.
- Bereiten Inseln für die Transplantation
- Isolieren Inselchen wie oben in den Schritten 2.0 bis 4.0 beschrieben. Falls erforderlich, können Inselchen am Tag der Transplantation oder vor isoliert werden.
- Pick-Inseln in Gruppen für die Transplantation, indem man sie in sterile 1,5 ml Eppendorph Röhren. Keep Röhrchen auf Eis. Die Anzahl der Inseln mussten Normoglykämie Wiederherstellung kann die Bedingungen des Experiments (Insel Donorstamm, Gewicht und Stamm des Empfängers und alle weiteren Behandlungen, die dem Empfänger) und die Person, die Kommissionierung der Inseln gegeben variieren. Die Größe des Empfängers Maus ist eine wichtige Variable, die minimale Anzahl Insel Einflüsse, wie größere Mäuse mehr Inselchen erfordern wird. Wir orientieren uns konsequent feststellen, dass 150 bis 250 Inseln nur geringfügig wieder Normoglykämie während 300 Inseln oder mehr ist in einem 18-kurativen zu C57BL / 6 Empfängermaus 20gram. In diesen Experimenten wurden die Insel Spender Mäuse entweder C57BL / 6 oder Balb / c.
- Transplant Inselchen zu subkapsulären Nieren Beutel
- Montieren Sie die folgenden Materialien (alle chirurgischen Instrumente sterilisiert werden müssen):
Tabelle 1. Ausrüstung für die Transplantation25 &mgr; l Hamilton-Spritze 6 "von PE 50 Schlauch geschnitten, so einseitig abgeschrägt Gel Be-und p200 Pipettenspitzen Sterile Eppendorph Rohre (1 pro Empfänger) Isofluran und Isofluran Verdampfer Eppendorph Röhrchenständer McPherson-Vannas Scissors (1) Bent Arm Pinzette (2) Hemostats (1) Wound-Clip mit Clips 27 Gauge-Nadel Flamme gezogen Glaskapillare Sonden * Wattestäbchen-Applikatoren 50ml konischen Rohr von sterilen PBS Nahtmaterial Elektrische Scheren 70% Ethanol Sprühflasche Kugelschreiber Betadine durchsichtigem Kunststoff sterilen Tuch
* Hinweis: Bei der Herstellung dieser Sonden, versuchen, einen Bogen in der Sonde, dass der Winkel der Maus Niere imitiert zu schaffen. Darüber hinaus gewährleisten, dass das Ende der Sonde ausreichend ist geflammt so poliert, dass keine scharfen Kanten vorhanden sind. - Wiegen und Tag alle Diabetiker Empfängermäuse. Weisen Sie jeder Maus eine experimentelle Gruppe vor der Transplantation, so dass jede Gruppe hat ebenfalls das Körpergewicht abgestimmt.
- Richten Sie eine OP-Feld innerhalb einer offenen Motorhaube mit dem Gasaustritt aus dem Isofluran Verdampfer ausgestattet.
- Anesthetize einen Empfänger Maus mit Isofluran und dann rasieren ihre Flanke mit der elektrischen Schere. Shave mit der Maus außerhalb des Gebietes, wo die Transplantation durchgeführt werden.
- Zurück Maus auf die Anästhesie und positionieren Sie es liegend senkrecht und direkt über die Welle von einem Glasstab, so dass die rasierte Flanke nach oben zeigt. Spray Flanke mit 70% Ethanol. Die Maus ist mit einem chirurgischen Macchia der alternierenden betadine und Alkohol dreimal wiederholt vorbereitet werden. Hängen Sie die Maus mit klaren sterilen Tuch den Zugriff auf die rasierte Flanke.
- Bereiten Sie die Inseln für die Transplantation bei der Maus wird betäubt. Tun Sie dies, indem Sie die folgenden Schritte.
- Legen Sie eine sterile Spitze für Gel in die Öffnung eines 1.5ml Eppendorph Rohr so, dass es eine sanfte Kurve, die eine U-Form macht in dem schmalen Ende der Spitze. Die Eröffnung der Spitze sollte bis unmittelbar gegenüberstehen aus dem Eppendorph Röhre. Nicht mit einem Knick an einer beliebigen Stelle in der Spitze für Gel, da dies in Scherung der Inselchen und eine Reduktion in der Anzahl der Inseln, die transplantiert führen wird.
- Vorsichtig aus dem Eis zu entfernen ein Rohr von Inseln, die in Schritt 5.2.2 vorbereitet wurde. Alle Inseln sollte am unteren Ende des Rohres gelöst werden. Mit einem p200 Pipette vorsichtig sammeln die kleinen Inseln in einem minimalen Volumen aus dem Boden des Röhrchens. Übertragen Sie diese Inseln durch die große Öffnung der Spitze für Gel in Schritt 5.3.6.1 vorbereitet. Die Inseln sollen in den engen Länge oder enge Beschränkung der Spitze für Gel zu begleichen.
- Nach dem Inselchen sedimentiert haben, entfernen Sie so viel von den Medien von der Spitze für Gel wie möglich. Dies kann mit Hilfe einer frischen Spitze für Gel an einem p200 Pipette durch Ansaugen der Medien durch die große Öffnung der Insel tragenden Spitze für Gel werden.
- Übertragen Sie die sedimentierten Inselchen in den PE 50 Schlauch (~ 15cm Länge). Dies kann zunächst durch Anbringen der nicht abgeschrägten Ende der Röhre auf die schmale Öffnung der Insel tragenden Spitze für Gel vor dem Anbringen der Spitze zu einem p200 Pipette durchgeführt werden. Die Inseln können dann bis 60% der Länge der Röhre geschoben werden.
- Übertragen Sie die Insel trägt PE 50 Schlauch mit einem 25 &mgr; l Hamilton-Spritze. Achten Sie darauf, den Spritzenkolben vor der Übertragung der Röhre wurde zurückgezogen. Schließen Sie die nicht-abgeschrägte Kante der PE 50 Rohre, die Nadel der Spritze.
- Drücken Sie den Kolben der Spritze bis zum Inselchen etwa 0,5 cm entfernt sind von der abgeschrägten Öffnung.
- Legen Sie die Spritze beiseite, so dass die kleinen Inseln können zu einer einzigen Masse in der Nähe der abgeschrägten Öffnung des Rohres absetzen, während die Niere vorbereitet wird, um die Inseln zu erhalten.
- Mit den Fingern, lokalisieren die Niere durch die Haut der Maus unter Narkose. Der Schaft des Kugelschreibers sollte direkt unter dem Bereich, wo die Niere entfernt und ist senkrecht zur Wirbelsäule positioniert werden.
- Sobald der Niere lokalisiert ist, verwenden Sie die McPherson-Vannas Schere zu einer 2cm Schnitt durch die Lederhaut direkt darüber in einer Richtung senkrecht zum Rückenmark zu machen. Dieser Schnitt wird Setzen Sie das Bauchfell.
- Mit dem McPherson-Vannas Schere einen 1cm Schnitt durch die Bauchdecke in die gleiche Richtung wie der Schnitt durch die Hautschicht. Es ist wichtig, dass die Öffnung durch diesen Einschnitt geschaffen kleiner als die Niere freigelegt werden.
- Mit der Welle der Glasstab als Rücklaufsperre, Kraft der Niere durch die peritoneale Öffnung durch Drücken auf the angrenzenden Fläche. Wenn die Öffnung ist etwas kleiner als die Niere, wird die Niere durch die Öffnung und Ruhe stabil auf der Oberfläche der Maus ohne zusätzliche Manipulation oder kontaktieren Sie quetschen. Diese Positionierung ist optimal für die nachfolgende Transplantation Schritte. Wenn die Öffnung zu groß ist, wird die Niere wieder fallen in die Bauchhöhle, so dass es schwer zu weiteren Schritten abgeschlossen.
- Befeuchten Sie die Oberfläche des freigelegten Nieren mit eiskaltem sterilem PBS mit einem getränkten Wattestäbchen. Wiederholen Sie diesen Schritt alle paar Minuten oder bei Bedarf auf die Nierenkapsel vor dem Austrocknen zu verhindern.
- Mit dem 27-Gauge-Nadel, eine 0.2cm Schnitt durch die Nierenkapsel über die vordere Oberfläche der Niere Wechsel von der linken seitlichen nach rechts lateral.
- Mit der Flamme gezogen Glaskapillare Sonde, erstellen Sie eine Tasche zwischen die Nierenkapsel und Nierenparenchyms. Tun Sie dies, indem Sie die Sonde durch den Schnitt im Schritt 5.3.12 gemacht und verschieben Sie sie in einen hinteren Richtung entlang der dorsal-lateralen Oberfläche der Niere. Eine ideale Sonde wird eine Biegung, dass die natürlichen Bogen von dieser Oberfläche der Niere entspricht. Damit wird die Sonde auf die hinteren Ende der Niere, ohne das Aufreißen einer großen vorderen Öffnung zu erreichen. Es ist wichtig, diese Tasche machen, wie lang und schmal wie möglich sein. Kurze breite Beutel sind nicht ideal, da sie kleine Inseln aus der Kapsel entweichen kann. Lang und schmal Beutel ermöglichen die Inseln in Richtung des hinteren Endes der Niere mit einem minimalen Verlust von Kapseltasche hinterlegt.
- Rufen Sie die 25 &mgr; l Hamilton-Spritze in Schritt 5.3.6 vorbereitet und verschieben Sie die kleinen Inseln an den Rand der abgeschrägten Öffnung des Schlauches.
- Legen Sie die abgeschrägte Kante des Schlauches in die subkapsulären Beutel in Schritt 5.3.13 vorbereitet. Die abgeschrägte Kante sollte nach oben, so dass die lange Kante in Kontakt mit dem Nierenparenchym ist. Bewegen Sie den Schlauch auf den hintersten Ende der Kapsel.
- Langsam Übertragung der Inseln aus dem PE 50 Schlauch in die subkapsulären Beutel durch Druck den Kolben der Spritze. Da die Inseln füllen den Beutel langsam wieder den Schlauch mit der Herstellung von mehr Raum für die kleinen Inseln zu hinterlegen. Stellen Sie sicher, dass alle Inseln aus der Tube in die Tasche übertragen. Füllen Sie den Beutel mit Luft oder überschüssige Flüssigkeit.
- Nach dem Entfernen der PE 50 Rohr aus dem Beutel, verwenden Sie die Flamme gezogen Glaskapillare Sonde sanft pack die kleinen Inseln in das proximale Ende des Beutels. Tun Sie dies, indem das Glas Sonde entlang der äußeren Oberfläche der Niere bewegt in eine vordere Richtung posterior. Seien Sie vorsichtig, nicht auf die Inseln zu eng, als das hintere Ende des subkapsulären Beutel können bersten Packung und lassen Sie die Inseln. Dieser Schritt minimiert den Verlust von Inseln aus der vorderen Öffnung des Beutels, wenn die Niere zurück in die Bauchhöhle gelegt.
- Mit einem angewinkelten Arm Zange heben die Peritonealüberzug neben der Öffnung für die Niere gemacht und dann mit einem PBS getränkten Wattestäbchen vorsichtig nach der Niere wieder in die Bauchhöhle.
- Schließen Sie die Maus, indem Nähte auf die Bauchdecke und Wundklammern in die Dermis.
- Bringen Sie die Maus auf seinem Käfig und wiederholen Sie die Schritte 5.3.4 bis 5.3.19 für die restlichen Mäuse. Mäuse sollten warm gehalten mit einem Heizkissen unter dem Käfig oder einer Wärmelampe mit den Augen geschützt werden, bis die Maus vollständig erholt aus der Narkose. Die Tiere sollten mit acetominophine im Wasser (6 mg / mL) zur Verfügung gestellt werden.
- Überprüfen Sie nicht nüchternen Blutzuckerspiegel 24 Stunden später. Alle Mäuse sollten normoglykämische (Blutzucker <200mg/dl) bei postoperativen Tag (POD) 1.
- Montieren Sie die folgenden Materialien (alle chirurgischen Instrumente sterilisiert werden müssen):
6. Repräsentative Ergebnisse
Zwei wichtige Verfahren sind in diesem Protokoll beschrieben: (1) Insel Isolation und (2) Inseltransplantation unter die Nierenkapsel. In der kleinen Insel Isolierung, Inselchen Erträge liegen typischerweise im Bereich zwischen 100-150 Inseln pro Maus je nach Alter und Beanspruchung. Die Reinheit dieser Inseln im Hinblick auf ihre Trennung von den exokrinen Zellen des Pankreas kann stark variieren zwischen einzelnen Zubereitungen enthalten. Doch der Einsatz von Raumtemperatur Histopaque1077 in Schritt 3.3.7 und ein 0,1 mm Nylon-Filter in Schritt 3.3.17 in der Regel für mehr als 99% Reinheit von Inselchen zu ermöglichen. Diese Reinheit ist, bevor weitere Handlese der Inseln erreicht. Repräsentative Bilder der Inseln nach der Isolierung sind in Abbildung 8D gezeigt. Wie in diesen Bildern zu sehen, die kleinen Inseln haben in der Regel eine grobe peripheren Grenze unmittelbar nach der Isolierung. Doch mit der Zeit in Kultur, wird gesund Inseln erwerben und aufrechterhalten, glatten Rand (Abbildung 8D). In einigen kleinen Inseln, wird eine zentrale nekrotische Region zu entwickeln,erscheinen als dunkler Bereich in den Kern. Diese nekrotischen Zentrum ist oft von der Insel vertrieben, wie Zeitraffer-Imaging (Supplemental Video 1) erfasst. Die restlichen Inseln erscheinen Vertiefung in der Mitte (Daten nicht gezeigt) und vermutlich auch nicht funktionsfähig. So schließen wir Inselchen mit dunkler Mitte während der Hand Kommissionierung. Wichtig ist, fanden wir, dass eine niedrige Temperatur der Inkubation nach der Isolierung (Schritt 4,2) drastisch reduzieren können die Anzahl der Inseln, die zentrale Nekrose in der Kultur entwickeln im Laufe der Zeit.
In der Insel-Transplantation Verfahren, sind zwei Schritte entscheidend: chemische Induktion von Diabetes und Lieferung von kleinen Inseln an der Niere sub-Kapsel-Bereich. Für Diabetes-Induktion, ist das Ziel, Hyperglykämie in mehr als 90% der STZ-injizierten Mäusen zu erreichen. Diese Mäuse werden ohne Transplantation für mehrere Wochen überleben. Die optimale Dosierung von STZ dieses Ziel zu erreichen, hängt von Mausstämme und Alter, und sollte von experimentell bestimmt werden. Wir fanden, dass ein Unterschied so klein wie 20mg/kg Körpergewicht kann einen großen Unterschied machen. Daher sollte eine Titration mit engen Abständen durchgeführt werden. Für Insel-Transplantation ist ein wichtiger Aspekt der Modelle, die vier immunologische Zusammenhänge haben kann: syngenen, allogenen, syngenen autoimmune und allogenen autoimmune. In der syngenen Modell ist die Donorstamm die gleiche wie die Rezipienten-Stamm. So würden die kleinen Inseln nicht auf die adaptive-Immunantwort von den Empfängern. Dies ermöglicht es den Forschern, die Themen rund um untersuchen "primary non-function", ein Begriff, der Dysfunktion und Verlust durch andere Gründe als spezifische Immunabwehr von den Empfängern Insel. Primäre Non-Funktion wird vermutet, dass der Hauptgrund für die Insel Misserfolg in den frühen Transplantation Bühne und für die Anforderung von einer großen Anzahl von kleinen Inseln (≥ 2 Bauchspeicheldrüsen / Patient) zu Normoglykämie zu erreichen. So ist es ein wichtiges Thema für Inseltransplantation. In diesem Modell eine marginale Insel Masse, die nicht vollständig wiederhergestellt Normoglykämie verwendet werden sollte und die Mäuse sollten Blutzucker in einem frühen Stadium werden nach der Transplantation untersucht, typischerweise zwischen POD 1 bis POD 7. In unserer Erfahrung ist eine marginale Masse der kleinen Inseln in der Regel zwischen 150 und 250 durchschnittlich großen Inseln pro 20 Gramm Empfänger mit der C57BL / 6 Stamm von Mäusen. Mit der syngenen Modell, kann man genetisch oder pharmakologisch verändert Inselchen zu testen, ob eine bestimmte Modulation der therapeutischen Wirksamkeit der Inseln betrifft in einem frühen Stadium nach der Transplantation.
In der allogenen und Autoimmun-Modellen sind die Inselzellen Transplantate eine spezifische Immunantwort Angriff der Gastgeber adaptive-Immunität, die T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und anderen Immunzellen ausgesetzt. Adaptive-Immunität ist eine verzögerte Immunantwort; dem Test diese Antwort, ist es notwendig, eine sättigende Anzahl der Inseln, die effektiv wieder Normoglykämie in einem frühen Stadium Transplantation nach der Transplantation die Auswirkungen der primären nicht-Funktion zu minimieren. Dann kann man beobachten, wie lange vor dem Inselchen abgelehnt werden als durch den Verlust von Normoglykämie angegeben, um die Auswirkungen einer etwaigen Änderung der Inseln auf der Abstoßung zu bestimmen. Nach unseren Erfahrungen sind mehr als 300 Inseln pro 20 Gramm Maus erforderlich und von 15 bis 21 Tage sind die Ablehnung der Zeit für eine allogene Transplantation mit Balb / c (H-2 d) als Spender und C57BL / 6 (H-2 b) als Empfängern.
Abbildung 1. Auffinden der Zwölffingerdarm Eröffnung des Choledochus. Endogene Verdauungsenzyme Ablassen von der Leber, der Bauchspeicheldrüse und der Gallenblase durch den gemeinsamen Gallengang passieren, bevor sie den Darm in den Zwölffingerdarm. Die Richtung der Strömung durch diesen Kanal kann umgekehrt werden, wenn Druck auf das System durch zusätzliche externe Flüssigkeit aufgetragen werden. Dies wird in der Bauchspeicheldrüse immer voll und aufgetrieben führen.
Abbildung 2. Spannen der Zwölffingerdarm Eröffnung des Choledochus. Um die Bauchspeicheldrüse mit Liberase zu füllen, ist es notwendig, den Zwölffingerdarm Eröffnung des Choledochus zu blockieren. Wenn dies nicht erreicht ist richtig, wird Liberase füllen den Darm statt der Bauchspeicheldrüse.
Abbildung 3. Neupositionierung der Leber gegen die Membran ermöglicht die Visualisierung der proximalen Bereich des Choledochus. Kanülierung des Choledochus kann höchst erfolgreich erreicht werden, wenn es in der Nähe seines proximalen Endes versucht wird (auf der V-förmigen Zusammenfluss in 2.3.1 beschrieben).
Abbildung 4. Cannulating den Gallengang von der "freienHand "-Methode. Ein Zusammenfluss von Choledochus wird sichtbar, wenn die Blutstillung, die über den Zwölffingerdarm eingespannt ist zum hinteren Ende der Maus gezogen wird. Duct Kanülierung kann, indem die 27-Gauge-Nadel an dieser Einmündung und der Fahrt durch sie erreicht werden.
Abbildung 5. Cannulating den gemeinsamen Gallengang durch die "Zange zu helfen"-Methode. Wie im Text erwähnt, manchmal auch die Faszien-Gewebe um den Kanal macht es schwierig, kanülieren. (A) In diesen Fällen ist es sinnvoll, die Gesichts-Schicht mit der 27-Gauge-Nadel klar. (B) Der Kanal kann dann übersichtlich visualisiert und unterstützt durch ein Paar von gebogenen Arm Pinzette. (C) Mit Hilfe der Zange als Rücklaufsperre, kann die 27-Gauge-Nadel in den Kanal für die Lieferung von Liberase eingefügt werden.
Abbildung 6. Selbst Ausbau der Bauchspeicheldrüse zeigt optimale Nadel Platzierung. Angesichts der durchscheinende Charakter des Kanals und die umliegenden Fasziengewebe, in einigen Fällen kann es scheinen, dass der Kanal wurde eine Kanüle während es in Wirklichkeit nicht hat. Wenn dies der Fall, und die Nadel dringt in das Pankreas Kapsel wird der Zwölffingerdarm-Region der Bauchspeicheldrüse beginnt mit der Lieferung der Liberase erweitern. Allerdings wird die gesamte Bauchspeicheldrüse nicht durchblutet werden, und dies wird in geringer Insel Ertrag führen. Um dieses Problem zu vermeiden, denn selbst Ausbau der Bauchspeicheldrüse durch die gezielte Suche nach Anzeichen des Enzyms in den Bereich der Bauchspeicheldrüse an den vorderen Teil des Magens zu beobachten.
Abbildung 7. Entfernen der perfundierten Pankreas. Um das Pankreas von der Maus zu entfernen, müssen mehrere Berührungspunkte mit den Eingeweiden gebrochen werden. (AB) Separate der Bauchspeicheldrüse aus dem Darm. (C) Separate der Bauchspeicheldrüse aus dem Magen. (D) Separate der Bauchspeicheldrüse aus dem Darm. (EF) Cut verbleibenden Kontakte mit der Bauchhöhle.
Abbildung 8. Repräsentative Bilder von Inselchen. Die relative Reinheit und Qualität der Inseln kann mikroskopisch nach Abschluss der Isolierung geschätzt werden. (A) Während das Ziel ist es, kleine Inseln aus der Bauchspeicheldrüse zu reinigen, sind exokrinen Zellen und Trümmer gelegentlich vorhanden. (B) Der Stress der Insel Isolation Zelltod, die so dunkel zentralen Regionen der Inseln und Ablösung von Zellen aus dem Inselchen Peripherie manifestiert. (C) Bei der Kommissionierung Inselchen für ein Experiment, zu vermeiden Kommissionierung der kontaminierenden exokrinen Zellen. (D) Islets in Erscheinung mit der Zeit in Kultur zu verändern. Wie kleine Inseln aus der Isolation zu erholen, erwerben sie eine glatte Umfangsfläche. Gelegentlich in größeren Inseln einen dunklen zentralen Region sichtbar ist. Diese Zellen färben positiv für den Zelltod.
Zusätzliche Video 1. Zeitraffer-Mikroskopie von post-Isolierung Inselchen. In diesem 16hr Zeitraffer-Video der Inseln sehen der Entwicklung nekrotischen Zentren, die letztlich ausgeworfen werden. Bitte klicken Sie hier für das Video .
Discussion
In den vorangegangenen Abschnitten haben wir beschrieben, detaillierte Schritte zur Isolierung und Transplantation der Maus Pankreasinseln. Hier haben wir kurz auf die Schritte, die entscheidend für den Erfolg der Verfahren sind.
1. Islet Isolation
Die entscheidenden Schritte sind die Identifizierung eine optimale enzymatische Verdauung der Zeit (1,4), die Positionierung der hemostat Klammer über den Zwölffingerdarm Eröffnung des Choledochus (2.2.3), cannulating den gemeinsamen Gallengang (2,3), kräftiges Schütteln der Bauchspeicheldrüse nach der 37 ° C verdauen (3,2) und für die Beseitigung der exokrinen Zellen Verunreinigungen (3.3.7 und 3.3.16). Diese Schritte haben einen dramatischen Einfluss auf die Qualität, Ausbeute und Reinheit von Inselchen. Vielleicht ist der technisch anspruchsvollsten Schritt ist die Kanülierung des Choledochus. In vielen Mäusen kann der Choledochus nur schwer zu visualisieren aufgrund umgebenden Faszien. Daher ist es üblich, dass Versuche, die Choledochus Ergebnis der Penetration der Faszie Gewebe nur kanülieren. In diesen Fällen beginnt die Liberase auf das umgebende Bindegewebe zu füllen und nicht perfuse der Bauchspeicheldrüse. Wenn dies eingehalten wird, stoppen den Fluss der Liberase und positionieren Sie die Nadel so, dass es dringt in das Lumen des Gallengangs. Mit etwas Übung ist es möglich, schnell die optimale Position für Nadel-Platzierung und die Kanülierung ohne Beschädigung der brüchigen Kanal abgeschlossen.
2. Inseltransplantation
Die entscheidenden Schritte sind die STZ Induktion von Diabetes (5,1) und die effiziente Bereitstellung von kleinen Inseln, die subkapsulären Beutel (5.3.14-5.3.16). STZ ist ein natürlich vorkommendes Glucose-Analogon, das selektiv toxisch auf die Insulin-sezernierenden Zellen β-Zellen der Inseln 9 ist. Allerdings tritt diese selektive Toxizität in einem relativ engen Konzentrationsbereich. Dies wird durch die Tatsache, dass hohe Dosen von STZ kann in schnellen (2-3 Tage) Letalität in der Abwesenheit von Hyperglykämie Ergebnis belegt. Daher sollte darauf geachtet werden, um die optimale Dosis von STZ für den Stamm und Alter der Mäuse sein, bevor eine breit angelegte Erprobung eingeleitet zu identifizieren sein. Die physische Lieferung der Inseln, die subkapsulären Beutel ist auch ein wichtiger Schritt. Um dies zu erreichen konsistente Ergebnisse, ist es unerlässlich, den Verlust der Inseln während der Auslieferung zu minimieren. Dies kann auftreten, wenn Mängel oder Tränen in die Nierenkapsel für die Tasche sind oder wenn das injizierte Volumen ist zu groß. Eine Beschädigung der Kapsel kann durch sanfte und schonende Manipulation und mit glatten Glas-Sonde, die subkapsulären Beutel Vorbereitung vermieden werden. Darüber hinaus kann das Injektionsvolumen mit sorgfältiger Entfernung des Überstands in Schritt 5.3.6.3 minimiert werden. Wenn der Überstand bis auf die Ebene des sedimentierten Inseln entfernt, gibt es in der Regel mehr als genug Platz in der subkapsulären Beutel zu 400 bis 500 Inseln statt. Allerdings, wenn das Injektionsvolumen zu groß ist, sind die Inseln eher Leck aus dem Beutel während der Transplantation, dabei die Reproduzierbarkeit des Experiments.
In diesem Protokoll ist es möglich, einige der Schritte verändern und immer noch zufriedenstellende Ergebnisse. Dazu gehören die folgenden: (a) die Verwendung eines anderen Enzyms der Bauchspeicheldrüse verdauen, (b) eine andere Methode für die Bereitstellung des Enzyms an der Bauchspeicheldrüse, (c) die Verwendung eines kontinuierlichen Ficoll-Natrium-Diatrizoat (FSD) Gradienten anstelle des einzigen Dichte Histopaque1077 Schritt, und (d) Inseltransplantation zu anderen Orten als der Niere subcapsule.
- In diesem Protokoll wird Liberase verwendet, um die Zell-Zell-Kontakte in der Bauchspeicheldrüse zu schwächen. Liberase ist im Wesentlichen ein Gemisch aus hochreinem Kollagenasen, die sich bewährt haben, bei der Freisetzung von Inseln aus der Bauchspeicheldrüse. Allerdings sind weniger gereinigt Kollagenasen zu leisten imstande ein ähnliches Ergebnis. Daher ist es möglich, verschiedene kommerziell erhältliche Enzympräparate für die Verdauung der Bauchspeicheldrüse zu verwenden, solange die Verdauung optimal eingestellt ist, um hohe Qualität zu erreichen Insel, Ausbeute und Reinheit.
- Es ist auch möglich, die Bauchspeicheldrüse ohne duktale Perfusion des Enzyms zu verdauen. Lieferung von Liberase durch den Choledochus ermöglicht maximale Exposition von Pankreas-Fläche an das Enzym. Dies führt zu mehr auch die Verdauung der Bauchspeicheldrüse und eine größere Freisetzung von intakten Inseln. Jedoch können auch andere Schritte, um die Oberfläche der Bauchspeicheldrüse an das Enzym zu erhöhen verwendet werden. Zum Beispiel kann Zerkleinern der Bauchspeicheldrüse vor Inkubation in Liberase oder direkt injiziert Liberase durch die Pankreas-Kapsel verwendet, um Inseln zu isolieren. Allerdings ist kein anderes Verfahren zur Liberase Lieferung so effektiv wie Perfusion durch den gemeinsamen Gallengang. Daher sollten Zerkleinern oder Direkteinspritzung als letztes Mittel reserviert werden, wenn der Choledochus ist beschädigt und nicht perfundierbaren.
- Eine alternative Methode zur Trennung von den Inseln aus dem exokrinen Zellen umfasst dieVerwendung eines FSD Farbverlauf statt Histopaque1077 10. Die effiziente Trennung von Inseln aus exokrinen Zellen in diesem Protokoll ist zum Teil auf eine Dichte Differenz zwischen den beiden Zelltypen. Histopaque1077 hat eine Dichte von 1,0771 g / ml bei 25 ° C. Bei dieser Temperatur ist Histopaque dichter als die Inseln, aber weniger dicht als die exokrinen Zellen. Daher unter der Kraft der Zentrifugation Histopaque1077 Pellets der exokrinen Zellen beim Anheben der Inseln an der Oberfläche. Im Prinzip kann jede andere Substanz mit einer Dichte, dass Inseln von exokrinen Zellen trennen kann in diesem Schritt verwendet werden und die FSD Gradient ist ein solcher Stoff.
- In Bezug auf die Lage für kleine Inseln Transplantation wird die Nierenkapsel in diesem Protokoll verwendet eine der wenigen möglichen Standorten. Während der Niere subcapsule ist die am häufigsten berichteten Ort der Transplantation in Mäuse, haben andere Transplantation Standorten als wirksam erwiesen, und sie gehören der Pfortader, subretinalen Raum, Hoden, Nebenhoden Fettpolster, Milz, Bauchspeicheldrüse und sogar 11-14. Jeder dieser Orte hat seine eigenen Vorteile und Herausforderungen. Daher sollte die Auswahl eines Standortes für Inseltransplantation durch die Fragen angesprochen und spezifischen Gegebenheiten der Experimente bestimmt werden.
Es wird angenommen, dass die Strategien, die die Grenzen auf Inseltransplantation überwinden können, werden drastisch verbessern sein therapeutisches Potential. Daher bietet der Einsatz von einem Mausmodell so detailliert durch dieses Protokoll einen attraktiven Ansatz zur Identifizierung solcher Strategien.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch RO1 DK064938 (TH) unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 31800-022 | |
| Liberase TL | Reagent | Roche Group | 05401020001 | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Histopaque1077 | Reagent | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Penicillin Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Sodium Citrate | Reagent | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Streptozotocin | Reagent | Sigma-Aldrich | S-0130 | |
| HCl | Reagent | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Isoflurane | Reagent | Vedco, Inc. | ISOSOL | |
| Glass Capillary Tubes | Equipment | Fisher Scientific | 22362574 | |
| Insulin Syringe | Equipment | BD Biosciences | 329461 | |
| 27 Gauge Syringe Needle | Equipment | BD Biosciences | 305109 | |
| Hamilton Syringe #1702 | Equipment | Fisher Scientific | 14813133 | |
| 10cm Petri Plates | Equipment | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 6cm Petri Plates | Equipment | Fisher Scientific | 07770212 | |
| 6-0 Suture | Equipment | Ethicon Inc. | 8726H | |
| PE 50 Flexible Tubing | Equipment | Fisher Scientific | NC9083963 | |
| 5ml Disposable Syringe | Equipment | BD Biosciences | 309603 | |
| 50ml Conical Tube | Equipment | BD Biosciences | 352098 | |
| 15ml Conical Tube | Equipment | BD Biosciences | 352097 | |
| 0.1mm Nylon Mesh | Equipment | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.419mm Wire Mesh | Equipment | Newark Wire Cloth Company | 0300241 | |
| Water Bath Incubator | Equipment | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
| Dissecting Microscope | Equipment | Carl Zeiss, Inc. | Stemi SV6 | |
| Inverted Microscope | Equipment | Nikon Instruments | TMS | |
| Tissue Culture Incubator | Equipment | Napco | 6300 | |
| Dissecting Scissors | Equipment | Kent Scientific | INS14393 | |
| McPherson-Vannas Scissors | Equipment | Kent Scientific | INS500260 | |
| Curved Forceps | Equipment | Kent Scientific | INS15915 | |
| Hemostatic Forceps | Equipment | Kent Scientific | INS 500451 | |
| Isoflurane Nebulizer | Equipment | Smiths Medical | ISOTech 4 OHMEDA | |
| Swing Bucket Centrifuge | Equipment | Dupont – Sorvall | RT6000D | |
| Swing Bucket Rotor | Equipment | Dupont – Sorvall | H1000B | |
| pH Meter | Equipment | Mettler Toledo | 09313509 | |
| Gel Loading Tips | Equipment | Fisher Scientific | 05408151 | |
| p200 Tips | Equipment | USA Scientific, Inc. | 111-0730 |
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