Summary
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा एक आदर्श मॉडल लार्वा कमानी नसों के भीतर axonal परिवहन के तंत्र की जांच प्रणाली प्रदान करते हैं. इस कार्यविधि का उपयोग, 3 Rd instar विभिन्न म्यूटेशनों ले जाने के लार्वा को जंगली प्रकार लार्वा की तुलना में किया जा सकता है.
Abstract
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर और तंत्रिका तंत्र के विकास समारोह के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल विशेष रूप से अपने सुविधाजनक आनुवंशिकी और पूरी तरह से अनुक्रम जीनोम की वजह से, सिस्टम के रूप में उभर रहा है. इसके अतिरिक्त, लार्वा तंत्रिका तंत्र एक आदर्श मॉडल प्रणाली axonal परिवहन के तंत्र का अध्ययन करने के रूप में लार्वा कमानी नसों अपने सेल शरीर मस्तिष्क और उनके तंत्रिका टर्मिनलों शरीर की लंबाई के साथ समाप्त होने के भीतर स्थित के साथ axons की बंडलों होते है. यहाँ हम synaptic पुटिका प्रोटीन के लार्वा कमानी नसों के भीतर दृश्य के लिए प्रक्रिया का वर्णन. यदि सही ढंग से किया, तंत्रिका तंत्र के सभी घटकों, जैसे मांसपेशियों और NMJs जुड़े के ऊतकों के साथ साथ, अक्षत, undamaged, और visualized किया जा के लिए तैयार रहना. 3 Rd instar विभिन्न म्यूटेशनों ले लार्वा विच्छेदित कर रहे हैं, तय, synaptic पुटिका एंटीबॉडी के साथ incubated कल्पना और जंगली प्रकार लार्वा की तुलना में. यह प्रक्रिया कई अलग synaptic या neuronal और एंटीबॉडी प्रोटीन की एक किस्म के वितरण में परिवर्तन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है आसानी से लार्वा कमानी नसों के भीतर देखा जा.
Protocol
1. अभिकर्मकों की तैयारी
- 1x विच्छेदन बफर का उपयोग कर 128 मिमी NaCl, 4mm 2 CaCl, 4mm 2 MgCl, 2 KCl मिमी, 5mm HEPES और 36mm Sucrose तैयार करें . पीएच 7.2 समाधान और फिल्टर बाँझ.
- 16% formaldehyde और 1x विच्छेदन बफर के कमजोर पड़ने 1:01 का उपयोग लगानेवाला तैयार.
- 1x पीबीटी 1x फास्फेट का उपयोग कर तैयार एक 1:100 अनुपात में 7.2 और X-100 ट्राइटन की एक पीएच में खारा (पीबीएस) buffered.
- तैयार 5% 0.01% 1x पीबीएस में azide ना गोजातीय सीरम albumin (BSA).
2. विच्छेदन के लिए तैयार
- Sylgard व्यंजन विच्छेदन के लिए उपयोग किया जाता है. Sylgard 184 सिलिकॉन elastomer आधार डालने के लिये और एक पेट्री डिश में एजेंट के मिश्रण इलाज व्यंजन तैयार करें. मिश्रण पूरी तरह से और जमना के लिए उपयोग करने से पहले सूखे की अनुमति दें.
- विच्छेदन के पहले, # 5 संदंश की एक साफ जोड़ी, सीधे ब्लेड vannas कैंची की एक साफ जोड़ी, और पिन इकट्ठा.
3. 3 Rd Instar लार्वा के विच्छेदन
- एक पेट्री डिश पर एक विशेष जीनोटाइप के 3 Rd instar लार्वा भटक लीजिए.
- विआयनीकृत जल में लार्वा के भोजन के छुटकारा धो लें.
- Sylgard पकवान पर लार्वा पृष्ठीय तरफ ऊपर के साथ, प्लेस. इसके पूर्वकाल और कूल्हों छोर पर लार्वा पिन.
- टिकी लार्वा पर 1x विच्छेदन बफर की एक बूंद रखें. ठीक कैंची चुटकी पीछे अंत के पास पृष्ठीय midline पर लार्वा का उपयोग करना. कैंची का प्रयोग, पीछे के अंत से पूर्वकाल अंत के माध्यम से लार्वा छल्ली में कटौती.
- Dissected लार्वा पर नए 1x विच्छेदन बफर की एक बूंद रखें. एक पिन का उपयोग, लार्वा के बीच निकट के छल्ली के पार्श्व में बढ़त लेने और छल्ली पिन. एक और पिन का उपयोग, के रूप में चित्र में दिखाया गया छल्ली के दूसरे पार्श्व बढ़त पिन. दो पिन प्रत्येक पार्श्व पक्ष पर इस्तेमाल किया जाता है. नीचे आरेख देखें.
- ध्यान से आंतों, वसा शरीर, ट्रेकिआ और निकालने के लिए, दो ऑप्टिकल कमानी जुड़ी नसों के साथ और उदर ganglia lobes के साथ ही मस्तिष्क छोड़ने. प्रक्रिया के शेष sylgard पकवान पर किया जाता है.
4. Dissected लार्वा के फिक्सेशन
- तय जगह हर 15 मिनट, 30 मिनट के लिए तय करने में dissected लार्वा सेते हैं.
- निर्धारण के बाद, 30 मिनट के लिए बफर जगह हर 10 मिनट 1x पीबीटी में लार्वा कुल्ला. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि लार्वा हमेशा एक बफर में होना चाहिए है.
5. Dissected लार्वा के एंटीबॉडी धुंधला
- उपयुक्त एकाग्रता के लिए यह 1x पीबीटी में ना azide के साथ 5% BSA में गिराए द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें. इष्टतम सांद्रता विभिन्न एंटीबॉडी के लिए अलग होगा.
- बदलें पिछले 1x पीबीटी तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ कुल्ला, और 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर एक नम कक्ष में सेते हैं. नम चैम्बर किम - पोंछे के साथ एक प्लास्टिक पकवान पानी में भिगो अस्तर द्वारा निर्मित है.
- अगले दिन, 30 मिनट के लिए बफर जगह हर 10 मिनट के द्वारा 1x पीबीटी में dissected लार्वा कुल्ला.
- उपयुक्त एकाग्रता के लिए यह 1x पीबीटी में ना azide के साथ 5% BSA में गिराए द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी तैयार है, और एक घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ लार्वा सेते हैं. लपेटें पन्नी में नम चैम्बर प्रकाश को रोकने के लिए, के रूप में माध्यमिक एंटीबॉडी संवेदनशील प्रकाश.
- ऊष्मायन के बाद, 30 मिनट के लिए बफर जगह हर 10 मिनट के द्वारा 1x पीबीटी में लार्वा कुल्ला.
6. बढ़ते और dissected लार्वा के विज़ुअलाइज़ेशन
- स्लाइड पर लार्वा बढ़ते से पहले, नेल पॉलिश के बीच में दो खड़ी रेखा के प्रसार, एक स्थान के साथ एक कवर पर बैठने के लिए (आरेख देखें) पर्ची के लिए पर्याप्त द्वारा स्लाइड तैयार है. नेल पॉलिश पूरी तरह से सूखे चलो.
- स्लाइड पर खड़ी नेल पॉलिश लाइनें (आरेख देखें) के बीच अंतरिक्ष में बढ़ते बफर की एक बूंद रखें. स्लाइड अब बढ़ते के लिए तैयार है.
- के बाद पिछले 1x पीबीटी कुल्ला, धीरे पार्श्व पिन को हटा दें. छल्ली आंसू नहीं सावधान रहो.
- ध्यान शेष दो पिनों हटाने और संदंश के साथ लार्वा लेने और लार्वा तैयार स्लाइड पर क्षैतिज जगह है. यकीन है कि लार्वा खत्म रूप से फ़्लिप नहीं है और उन्मुख ventral तरफ ऊपर है.
- धीरे शीर्ष पर एक कवर पर्ची जगह और नेल पॉलिश के साथ किनारों मुहर (आरेख देखें). लार्वा अब एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे दृश्य के लिए तैयार है.
7. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1: एक जंगली प्रकार larv से लार्वा कमानी नसों के प्रतिनिधि छविsynaptic पुटिका प्रोटीन सिस्टीन स्ट्रिंग प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर (CSP, Zinsmaier एट अल 1994 .). ध्यान दें कि कमानी नसों सुचारू दाग हैं. बार = 20μm
चित्रा 2: एक मोटर प्रोटीन उत्परिवर्ती synaptic पुटिका प्रोटीन सिस्टीन स्ट्रिंग प्रोटीन (CSP) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग लार्वा से लार्वा कमानी नसों का एक प्रतिनिधि छवि. ध्यान दें कि कमानी नसों भारी राशि है कि CSP (तीर) के लिए चमकीले दाग दिखाने.
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Discussion
ड्रोसोफिला लार्वा कमानी नसों axonal परिवहन तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली रहे हैं. यदि 3 Rd instar लार्वा विच्छेदन सही ढंग से किया जाता है, CNS, पीएन, और जुड़े ऊतक मांसपेशियों और NMJs जैसे, के सभी घटकों को एक एकल लार्वा के भीतर जांच की जा सकती है. हम हर्ड और Saxton (1996) द्वारा प्रकाशित एक से इस प्रोटोकॉल अनुकूल है. इस प्रोटोकॉल अन्य neuronal एंटीबॉडी परीक्षण के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन एंटीबॉडी के अनुकूलन किया जाना चाहिए. प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन बार या बदला जा सकता है अवरुद्ध कदम जोड़ा जा सकता है. हम सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल को amyloid अग्रदूत प्रोटीन 1 और 2 axonal परिवहन में huntingtin की भूमिका की जांच का इस्तेमाल किया है .
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
एसजी से भैंस पर न्यूयॉर्क के राज्य विश्वविद्यालय और जॉन आर Oishei फाउंडेशन से धन के द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Minutien Pins, Stainless Steel | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Mcpherson-Vannas Straight Blade 8cm Scissors | Fisher Scientific | 50822236 | |
| Vectashield, Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Dow Corning | 4026148 | |
| formaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| dCSP3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 |
References
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).
- Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila. Science. 263, 977-980 (1994).
