Summary
Личинки дрозофилы обеспечивают идеальную модель системы для исследования механизмов аксонального транспорта в личиночной сегментарных нервов. Используя эту процедуру, 3-й возраста личинок проведения различных мутаций можно сравнить с диким личинки типа.
Abstract
Дрозофилы становится мощной системой модель для изучения развития и функционирования нервной системы, особенно из-за его удобного генетики и полностью секвенированы генома. Кроме того, личиночной нервной системы является идеальной системой моделью для изучения механизмов аксонального транспорта, а личиночные сегментарные нервы содержат пучки аксонов с их клеточных тел, расположенных в мозге и их нервными окончаниями конец по всей длине тела. Здесь мы опишем процедуру для визуализации белков синаптических пузырьков в личиночной сегментарные нервы. Если все сделано правильно, все компоненты нервной системы, а также связанные тканей, таких как мышцы и NMJs, остается целой, неповрежденной, и готовы быть визуализированы. 3-го возраста личинки перевозки различных мутаций рассеченные, фиксированной, инкубировали с антителами синаптических пузырьков, визуализации и по сравнению с диким типом личинки. Эта процедура может быть адаптирована для различных синаптические или нейронные антител и изменения в распределении различных белков может быть легко наблюдается в течение личиночной сегментарные нервы.
Protocol
1. Подготовка реагентов
- Приготовьте 1х Dissection буфера с использованием 128 мМ NaCl, CaCl 2 4 мм, 4 мм MgCl 2, 2 мМ KCl, 5 мМ HEPES и 36 Сахароза. PH решение до 7,2 и фильтр стерилизуют.
- Подготовка фиксатором использованием 1:01 разбавления 16% формальдегида и 1x буфера Dissection.
- Приготовьте 1х PBT использованием 1x фосфатно-солевым буфером (PBS) при рН 7,2 и Тритон Х-100 в 1:100 отношение.
- Подготовка 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) с 0,01% азида Na в 1x PBS.
2. Подготовка к Dissection
- Sylgard блюд используются для вскрытия. Подготовка блюд, поливая Sylgard 184 силиконового эластомера основы и отвердителя смесь в чашки Петри. Позвольте смеси полностью укрепить и сухой перед использованием.
- До вскрытия, собирать чистые пары # 5 щипцы, чистые пары прямым лезвием ножниц vannas, и булавки.
3. Препарирование 3 Личинки й Инстар
- Сбор блуждающих 3-го возраста личинки конкретных генотипов на чашке Петри.
- Вымойте личинок в деионизированной воде, чтобы избавиться от пищи.
- Место личинки на блюдо sylgard, с спинной стороной вверх. Pin личинки на переднем и заднем концах.
- Место капли 1x буфера Dissection на возлагали личинки. Использование тонких ножниц пресечь личинки на спинной средней линии у заднего конца. Использование ножницы, разрезать личиночной кутикулы от заднего конца до переднего конца.
- Место падения новых 1x буфера Dissection на расчлененный личинки. Использование PIN-код, выбрать одного бокового края кутикулы около середины личинки и пин-код кутикулы. Использование другого контактный, контактный второй боковой край кутикулы, как показано на рисунке. Два контакта используются на каждой боковой стороны. См. диаграмму ниже.
- Осторожно удалите кишечник, жир тела, и трахею, оставляя только мозг с двумя оптическими долями и брюшного ганглиев с сегментарных нервов прилагается. Остальная часть процедуры выполняется на блюдо sylgard.
4. Фиксация расчлененный Личинка
- Инкубируйте расчлененный личинки в исправить в течение 30 минут, заменив исправить каждые 15 минут.
- После фиксации, промыть личинки в 1x PBT в течение 30 минут, заменив буфера каждые 10 минут. Важно отметить, что личинки всегда должны быть в буфере.
5. Антитела Окрашивание расчлененный Личинка
- Подготовка первичных антител путем разбавления его в соответствующей концентрации в 5% БСА с Na азида в 1x PBT. Оптимальная концентрация будет отличаться для разных антител.
- Заменить последнее 1x PBT промыть подготовлено решение первичных антител и инкубируют во влажной камере при 4 ° С в течение ночи. Влажной камере строится подкладке пластиковая тарелка с Ким-салфетки, смоченной в воде.
- На следующий день промыть расчлененный личинки в 1x PBT в течение 30 минут, заменив буфера каждые 10 минут.
- Подготовка вторичные антитела путем разбавления его в соответствующей концентрации в 5% БСА с Na азида в 1x PBT, и инкубировать личинку с вторичными антителами решение при 25 ° С в течение часа. Оберните влажной камере в фольгу, чтобы предотвратить свет, как вторичные антитела светочувствительным.
- После инкубации промыть личинки в 1x PBT в течение 30 минут, заменив буфера каждые 10 минут.
6. Монтаж и визуализация расчлененный Личинка
- Перед установкой личинки на слайде, подготовить слайд, распространяя двумя вертикальными линиями лака для ногтей в середине, с пространства достаточно для покровным стеклом, чтобы сидеть на (см. схему). Пусть лак для ногтей полностью высохнуть.
- Место падения монтажного буфера в пространство между вертикальными линиями лака для ногтей на слайде (см. схему). Слайд готов для монтажа.
- После последнего 1x PBT промыть, аккуратно удалите боковые контакты. Будьте осторожны, чтобы не порвать кутикулы.
- Осторожно удалите две оставшиеся контакты и подобрать личинку пинцетом и место личинки горизонтально на подготовленных слайдов. Убедитесь, что личинки не перевернулся и ориентирована вентральной стороной вверх.
- Аккуратно покровным стеклом сверху и печатью края с лаком для ногтей (см. схему). Личинка готова к визуализации под флуоресцентным микроскопом.
7. Представитель Результаты
Рисунок 1: представитель образ личиночной сегментарные нервы от дикого типа larvс использованием антител против белков синаптических белков везикул строку цистеина (CSP, Zinsmaier и соавт. 1994). Обратите внимание, что сегментарные нервы гладко окрашенных. Bar = 20 мкм
Рисунок 2: представитель образ личиночной сегментарные нервы от белка двигателя мутант личинка с использованием антител против синаптических пузырьков белка цистеина строку белка (CSP). Обратите внимание, что сегментарные нервы показать массивные скопления, что пятно ярко для CSP (стрелки).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Дрозофилы личиночной сегментарные нервы мощная система для изучения механизмов в аксонального транспорта. Если 3-го возраста личиночной рассечение выполняется правильно, все компоненты ЦНС, ПНС, и связанные с ними тканей, таких как мышцы и NMJs, могут быть рассмотрены в рамках одной личинки. Мы адаптировали данный протокол от той, опубликованной Херд и Сакстона (1996). Этот протокол также может быть адаптирована для тестирования других нейронов антител, но оптимизация антител должно быть сделано. Первичные и вторичные антитела раз инкубации может быть изменен или блокирование шаг может быть добавлен. Мы успешно использовали этот протокол для исследования роли белка предшественника амилоида 1 и 2 в Huntingtin аксонального транспорта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
SG поддерживается за счет средств из государственного университета Нью-Йорка в Буффало и от Джона Р. Oishei Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Minutien Pins, Stainless Steel | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Mcpherson-Vannas Straight Blade 8cm Scissors | Fisher Scientific | 50822236 | |
| Vectashield, Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Dow Corning | 4026148 | |
| formaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| dCSP3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 |
References
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).
- Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila. Science. 263, 977-980 (1994).
