Summary
Drosophila melanogaster larvas fornecer um modelo de sistema ideal para investigar os mecanismos de transporte axonal dentro larval nervos segmentares. Usando este procedimento, 3 de larvas portadores de mutações diferentes podem ser comparadas às larvas do tipo selvagem.
Abstract
Drosophila melanogaster está emergindo como um sistema poderoso modelo para estudar o desenvolvimento e função do sistema nervoso, particularmente por causa de sua genética e conveniente genoma completamente seqüenciado. Além disso, o sistema nervoso das larvas é um sistema modelo ideal para estudar mecanismos de transporte axonal como os nervos larval segmentar contêm feixes de axônios com seus corpos celulares localizados dentro do cérebro e os seus terminais terminação nervosa ao longo do comprimento do corpo. Aqui nós descrevemos o procedimento para a visualização de proteínas dentro das vesículas sinápticas larval nervos segmentares. Se feito corretamente, todos os componentes do sistema nervoso, juntamente com tecidos associados, tais como músculos e NMJs, permanecem intactas, não danificadas, e pronto para ser visualizado. 3 º larvas carregando várias mutações são dissecados, fixo, incubado com anticorpos das vesículas sinápticas, visualizados e comparados com larvas do tipo selvagem. Este procedimento pode ser adaptado para vários diferentes anticorpos synaptic ou neuronal e as mudanças na distribuição de uma variedade de proteínas pode ser facilmente observado dentro larval nervos segmentares.
Protocol
1. Preparação dos Reagentes
- Prepare 1x tampão Dissecção com 128 mM NaCl, 4 mM CaCl 2, 4mm MgCl 2, 2 mM KCl, HEPES 5mM e Sacarose 36mm. PH da solução a 7,2 e filtro de esterilizar.
- Prepare o fixador utilizando 01:01 diluição de formaldeído 16% e solução tampão 1x Dissection.
- Prepare 1x PBT usando 1x Tampão fosfato salino (PBS) em um PH de 7,2 e Triton X-100 em uma proporção de 1:100.
- Prepare 5% albumina sérica bovina (BSA) com 0,01% Na Azida em 1x PBS.
2. Preparação para o Dissection
- Sylgard pratos são usados para dissecção. Prepare os pratos derramando Sylgard 184 base de elastômero de silicone de cura e agente de mistura em uma placa de Petri. Deixe a mistura solidificar completamente e seco antes de usar.
- Antes da dissecação, reunir um par limpo de # 5 fórceps, um par de tesouras limpas lâmina reta Vannas, e pinos.
3. Dissecção de 3 larvas rd
- Coletar vagando 3 ª larvas de um genótipo específico em uma placa de Petri.
- Lavar as larvas em água deionizada para se livrar da comida.
- Coloque uma larva no prato Sylgard, com o lado dorsal. Pin a larva em suas extremidades anterior e posterior.
- Colocar uma gota de tampão Dissection 1x na larva fixado. Usando uma tesoura fina beliscar a larva na linha média dorsal, perto da extremidade posterior. Usando a tesoura, cortar a cutícula larval da extremidade posterior até o final anterior.
- Colocar uma gota de tampão Dissection nova 1x para a larva dissecados. Com um pino, pegar uma borda lateral da cutícula perto do meio da larva alfinete e da cutícula. Usando outro pino, o pino da borda lateral do segundo cutícula, como mostrado no diagrama. Dois pinos são usados em cada lado lateral. Veja o diagrama abaixo.
- Remova cuidadosamente os intestinos, órgãos de gordura, e traqueia, deixando apenas o cérebro com os dois lobos ópticos e gânglios ventral com os nervos segmentares anexado. O restante do procedimento é feito no prato Sylgard.
4. Fixação da Larva Dissecada
- Incubar a larva dissecada em correção para 30 minutos, substituindo a correção a cada 15 minutos.
- Após a fixação, enxaguar a larva em 1x PBT por 30 minutos, substituindo o buffer a cada 10 minutos. É importante notar que a larva deve ser sempre em um buffer.
5. Coloração de anticorpos da Larva Dissecada
- Prepare o anticorpo primário, diluindo-lo para a concentração adequada em BSA 5% com azida em 1x Na PBT. Concentrações ideais serão diferentes para diferentes anticorpos.
- Substituir a última 1x PBT enxaguar com a solução de anticorpos preparados primária, e incubar em câmara úmida a 4 ° C durante a noite. A câmara úmida é construído por um prato de revestimento de plástico com kim-limpa embebido em água.
- No dia seguinte, lave a larva dissecados em 1x PBT por 30 minutos, substituindo o buffer a cada 10 minutos.
- Prepare o anticorpo secundário, diluindo-o para a concentração adequada em BSA 5% com azida em 1x Na PBT, e incubar a larva com a solução de anticorpo secundário a 25 ° C por uma hora. Enrole a câmara úmida em folha para evitar a luz, como anticorpos secundários são sensíveis à luz.
- Após a incubação, lavar a larva em 1x PBT por 30 minutos, substituindo o buffer a cada 10 minutos.
6. Montagem e visualização da Larva Dissecada
- Antes de montar a larva no slide, prepare o slide, espalhando duas linhas verticais de unha polonês no meio, com um espaço suficiente para uma cobertura de vidro para se sentar (ver diagrama). Deixe a unha polonês secar completamente.
- Coloque uma gota de tampão de montagem no espaço entre as linhas verticais unha polonês no slide (ver diagrama). O slide está pronto para a montagem.
- Após o último enxágüe 1x PBT, remova os pinos lateral. Tenha cuidado para não rasgar a cutícula.
- Remova cuidadosamente os dois pinos restantes e pegue a larva com uma pinça e coloque a larva horizontalmente no slide preparado. Certifique-se que a larva não é capotou e é orientada lado ventral para cima.
- Delicadamente, coloque uma lamínula em cima e feche as bordas com unha polonês (ver diagrama). A larva está agora pronto para visualização sob um microscópio fluorescente.
7. Resultados representante
Figura 1: A imagem representativa da larval nervos segmentar a partir de um tipo selvagem larvum usando anticorpos contra a vesícula sináptica protéicas cadeia cisteína (CSP, Zinsmaier et al. 1994). Note-se que os nervos segmentares são suavemente manchado. Bar = 20Hm
Figura 2: A imagem representativa da larval nervos segmentar a partir de uma larva mutante proteína motora utilizando anticorpos contra a proteína de vesícula sináptica proteína cadeia cisteína (CSP). Note-se que os nervos segmentares mostram acumulações maciças que mancha brilhante para CSP (setas).
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Discussion
Os nervos Drosophila larval segmentares são um poderoso sistema para estudar mecanismos de transporte axonal. Se o 3 º instar larval dissecção é realizada corretamente, todos os componentes do SNC, SNP e tecidos associados, tais como os músculos e NMJs, pode ser examinado dentro de uma larva único. Nós adaptamos este protocolo a partir do que foi publicado por Hurd e Saxton (1996). Este protocolo também pode ser adaptado para testar outros anticorpos neuronal, mas a otimização de anticorpos deve ser feito. Os tempos de incubação primária e secundária de anticorpos pode ser alterado ou um passo de bloqueio pode ser adicionado. Temos utilizado com sucesso este protocolo para investigar o papel da proteína precursora de amilóide 1 e 2 Huntingtin no transporte axonal.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
SG é apoiado por fundos da Universidade Estadual de Nova York em Buffalo e de John R. Oishei Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Minutien Pins, Stainless Steel | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Mcpherson-Vannas Straight Blade 8cm Scissors | Fisher Scientific | 50822236 | |
| Vectashield, Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Dow Corning | 4026148 | |
| formaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| dCSP3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 |
References
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).
- Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila. Science. 263, 977-980 (1994).
