Vi inför en snabb fluorescens-baserad analys som övervakar graden av fluorescens släcka som ett mått på gramicidin kanal aktivitet. Den gramicidin kanaler används som molekylära kraftgivare att övervaka förändringar i membranet egenskaper som kände av tvåskiktsmembran spänner proteiner.
Många läkemedel och andra små molekyler som används för att modulera biologiska funktionen är biomolekylära som absorberar vid tvåskiktsmembran / lösningen gränssnitt och därmed ändra egenskaperna membranet. Detta är viktigt eftersom membranproteiner är energiskt kopplade till sin värd tvåskiktsmembran med hydrofoba interaktioner. Förändringar i tvåskiktsmembran fastigheter förändrar därmed funktionen membran protein, som ger ett indirekt sätt för biomolekylära att modulera proteiners funktion och en möjlig mekanism för "off-target" läkemedelseffekter. Vi har tidigare utvecklat en elektrofysiologisk test för att upptäcka förändringar i membranet egenskaper med hjälp av linjär gramicidin kanaler som sonder 3,12. Gramicidin kanaler mini-proteiner som bildas av transbilayer dimerization av två icke-ledande subenheter. De är känsliga för förändringar i deras membran miljö, vilket gör dem kraftfulla sonder för övervakning av förändringar i fastigheter membranet som kände av tvåskiktsmembran spänner proteiner. Vi visar nu en fluorescens-test för att upptäcka förändringar i tvåskiktsmembran fastigheter med samma kanaler som sonder. Analysen är baserad på mätning av tid loppet av fluorescens släcka från fluoroforen-loaded stora unilamellar blåsor på grund av införandet av en törstsläckare genom gramicidin kanaler. Vi använder fluorescerande indikator / quencher par 8-Aminonaftalen-1 ,3,6-trisulfonate (myror) / TL + som framgångsrikt har använts i andra fluorescens släcka analyser 5,13. Tl + genomsyrar membranet sakta 8, men går lätt föra en gramicidin kanaler 1,14. Metoden är skalbar och passar både mekanistiska studier och high-throughput screening av små molekyler för tvåskiktsmembran-störande, och möjligheter "off-target", effekter. Vi finner att resultat med denna metod är väl överens med tidigare elektrofysiologiska resultat 12.
Vi har visat en snabb fluorescens-baserad analys för fastställande av tvåskiktsmembran ändra potentialen av droger och andra små biomolekylära. Föreningar som modifierar tvåskiktsmembran egenskaper sannolikt att ändra funktion membranprotein på ett indirekt, ospecifik sätt kan bidra till en "off-target" läkemedelseffekter. Analysen utnyttjar kraften i gramicidin kanaler som sonder för förändringar i tvåskiktsmembran fastigheter 12 som kände av tvåskiktsmembran-spänner proteiner. D…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Michael J. Bruno, Radda Rusinova och Jon T. Sack för många stimulerande diskussioner. Ekonomiskt stöd från NIH, R01GM021342 och Arra komplettera R01GM021342-35S1, och Josiah Macy, Jr Foundation att OSA, Tri-Jag CMB program för HII och Iris L. och Leverett S. Woodworth Medicinsk Forskare Gemenskap och NIH MSTP bevilja GM07739 för RK.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
ANTS | Invitrogen | A-350 | ||
gramicidin | Sigma Chemical Co | G-5002 | ||
1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850398C | ||
Mini-Extruder kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | ||
PD-10 Desalting column | Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare | 54805 |