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Biology

छोटे अणुओं लिपिड bilayer गुण को संशोधित करने के लिए संभावित निर्धारण के लिए, Gramicidin आधारित प्रतिदीप्ति परख

doi: 10.3791/2131 Published: October 13, 2010

Summary

हम एक तेजी से प्रतिदीप्ति आधारित परख कि gramicidin चैनल गतिविधि का एक उपाय के रूप में प्रतिदीप्ति शमन की दर पर नज़र रखता है परिचय. लिपिड bilayer गुणों में परिवर्तन के रूप में bilayer फैले प्रोटीन से महसूस की निगरानी gramicidin चैनल आणविक बल transducers के रूप में उपयोग किया जाता है.

Abstract

कई दवाओं और अन्य छोटे अणुओं के लिए जैविक समारोह मिलाना amphiphiles कि अंतरफलक / bilayer समाधान और जिससे सोखना लिपिड bilayer गुणों को बदलने के हैं. यह महत्वपूर्ण है क्योंकि झिल्ली प्रोटीन energetically hydrophobic बातचीत द्वारा अपने मेजबान bilayer के लिए युग्मित कर रहे हैं. Bilayer गुणों में परिवर्तन इस प्रकार बदल झिल्ली प्रोटीन समारोह है, जो एक अप्रत्यक्ष तरीका है amphiphiles के लिए प्रोटीन समारोह और "लक्ष्य" दवा प्रभाव के लिए एक संभव तंत्र मिलाना प्रदान करता है. हम पहले 3,12 जांच के रूप में रैखिक gramicidin चैनलों का उपयोग लिपिड bilayer गुणों में परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक electrophysiological परख विकसित किया है. Gramicidin चैनलों मिनी प्रोटीन दो गैर का आयोजन सब यूनिटों के transbilayer dimerization द्वारा गठित कर रहे हैं. वे उनके झिल्ली पर्यावरण, जो बनाता है उन्हें लिपिड bilayer गुणों में निगरानी परिवर्तन के लिए शक्तिशाली जांच के रूप में bilayer फैले प्रोटीन द्वारा महसूस में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हैं. अब हम जांच के रूप में एक ही चैनल का उपयोग bilayer गुणों में परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक प्रतिदीप्ति परख प्रदर्शित करता है. परख fluorophore लोड बड़े unilamellar gramicidin चैनलों के माध्यम से एक पेय के प्रवेश के कारण vesicles से प्रतिदीप्ति शमन के समय पाठ्यक्रम को मापने पर आधारित है. हम प्रतिदीप्ति जोड़ी / सूचक पेय 8 - aminonaphthalene 1 (चींटियों) ,3,6 trisulfonate / Tl + कि सफलतापूर्वक किया गया है अन्य प्रतिदीप्ति शमन assays के 5,13 में इस्तेमाल किया. उपयोग Tl + लिपिड bilayer 8 धीरे permeates लेकिन gramicidin 1,14 चैनलों के संचालन के माध्यम से आसानी से गुजरता है. विधि परिमाप्य और दोनों यंत्रवत अध्ययनों और उच्च throughput bilayer perturbing, और संभावित "बंद लक्ष्य", प्रभाव के लिए छोटे अणुओं की स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है. हम पाते हैं कि इस पद्धति का उपयोग करके परिणाम पिछले electrophysiological 12 परिणाम के साथ अच्छे समझौते में हैं.

Protocol

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1. चींटियों - भरा Liposomes उत्पन्न

  1. 1 दिन में लिपिड से विलायक कार्बनिक हटा दें.
  2. फ्रीजर से लिपिड निकालें और इसे कमरे के तापमान को संतुलित करना.
  3. 25 मिलीग्राम / एमएल के 0.6 एमएल (1,2 - dierucoyl - एस.एन. - glycero 3 phosphocholine) क्लोरोफॉर्म एक 25 एमएल दौर नीचे फ्लास्क के लिए समाधान में लिपिड जोड़ें.
  4. लगातार बारी बारी से फ्लास्क जबकि नाइट्रोजन के तहत सुखाने, जब तक सभी क्लोरोफॉर्म सुखाया और लिपिड फ्लास्क के पूरे निचले आधे कोट की एक पतली सफेद फिल्म.
  5. वैक्यूम के अंतर्गत एक dessicator रात भर में ड्राई.
  1. 2 दिन fluorophore कि vesicles में शामिल किया जाएगा के साथ नमूना तैयार करते हैं.
  2. 100 मिमी 3 नैनो, 25 मिमी चींटियों (ना नमक), 10 मिमी HEPES में rehydrate. 3 HNO या NaOH का प्रयोग 7.0 पीएच को समायोजित . प्रत्येक चींटियों अणु 150 मिमी की कुल के लिए दो ना + [ना + ] एक 10 मिमी लिपिड निलंबन इलेक्ट्रोलाइट के 1.671 एमएल जोड़ें.
  3. Parafilm और भंवर अच्छी तरह से निलंबन.
  4. प्रकाश से नमूना पन्नी के साथ रक्षा के लिए यह उम्र कमरे के तापमान पर रातोंरात.
  1. 3 दिवस पर, बड़े unilamellar vesicles और vesicles के बाहर से सभी fluorophore हटायें.
  2. एक कम शक्ति sonicator में 1 मिनट के लिए Sonicate.
  3. रुक पिघलना नमूना 5-6 बार, सूखी बर्फ और गर्म (~ 50 डिग्री सेल्सियस) पानी में 5 मिनट पर 5 मिनट के साथ हर बार.
  4. लिपिड निलंबन का उपयोग कर एक मिनी extruder अवंती बाहर निकालना. एक 0.1 सुक्ष्ममापी polycarbonate फिल्टर और फिल्टर का समर्थन करता है (विवरण के लिए extruder पुस्तिका देखें) के साथ मिनी extruder सेट. निलंबन के आगे और पीछे 21 बार ऐसी है कि निलंबन विपरीत सिरिंज पर समाप्त होता है बाहर निकालना. जब एकाधिक बैचों extruded कर रहे हैं, हमेशा एक ही सिरिंज के साथ नमूने लोड करने के लिए याद है. बाहर निकालना के दौरान बादल प्रारंभिक लिपिड निलंबन लगभग पारदर्शी बन चाहिए (यह अभी भी चींटियों fluorophore के कारण पीले हो जाएगा). यदि अचानक बाहर निकालना आसान हो जाता है और कम दबाव फिल्टर के माध्यम से स्थानांतरित करने की जरूरत है, फिल्टर और उठी हो सकता है के लिए जगह की आवश्यकता होगी.
  5. एक desalting पीडी 10 एक गुरुत्व प्रोटोकॉल का उपयोग कर स्तंभ पर extruded निलंबन चलाकर बाहरी चींटियों निकालें. ना - बफर के 20-30 एमएल के साथ स्तंभ संतुलित करना (140 मिमी 3 नैनो, 10 मिमी HEPES, 7.0 पीएच, HNO 3 या NaOH का उपयोग करने के लिए पीएच समायोजित याद है) . कॉलम को extruded लिपिड निलंबन की 1.5 एमएल जोड़ें और इसे अंदर रिसना 1 एमएल ना - बफर जोड़कर नमूना की कुल 2.5 एमएल मात्रा लाओ. बाद बफर स्तंभ में पूरी तरह से शामिल किया है और कुछ नहीं से बाहर लीक कर रहा है, ना - बफर के 3 एमएल के साथ liposomes elute और परिणामस्वरूप नमूना इकट्ठा. परिणामस्वरूप भरा चींटियों Luv शेयर समाधान के बारे में 4-5 मिमी लिपिड होते हैं और पारदर्शी दूधिया सफेद प्रकट करना चाहिए. पन्नी के साथ प्रकाश से नमूना सुरक्षित रखें.
  6. अगर शेयर समाधान तुरंत उपयोग नहीं किया है 13 पर दुकान, ° सी 7 दिनों की एक अधिकतम के लिए. चेतावनी: फ्रीज या नहीं क्रिस्टल चरण संक्रमण तापमान (12 ~ डिग्री सेल्सियस), के रूप में इस vesicles अखंडता को नष्ट करने और fluorophore बाहर रिसाव जाएगा तरल नीचे लिपिड समाधान शांत करते हैं.

2. मिक्स प्रतिदीप्ति समाधान

  1. 24 घंटे से पहले का उपयोग करें, liposomes पतला और gramicidin साथ सेते (13 ° C पर). Gramicidin के लिपिड 'vesicles के भीतरी और बाहरी monolayers के बीच संतुलन एक धीमी प्रक्रिया है, एक लंबी ऊष्मायन की आवश्यकता होती है.
  2. अच्छी तरह भंवर शेयर समाधान Luv रूप LUVs एमएल> 1 जी / घनत्व है चींटियों - भरा है और इसलिए समाधान में तलछट जाएगा.
  3. मिक्स चींटियों भर में ना - बफर स्टॉक 1:20 Luv. प्रयोगों की एक दिन में इस्तेमाल के लिए सभी liposomes नमूना एकरूपता बढ़ाने के लिए एक एकल फ्लास्क में एक साथ मिक्स.
  4. Liposomes की 3 / 4 अलग और 260 एनएम DMSO में पूर्व - पतला gramicidin (500 μg / एमएल) जोड़ने.
  5. शेष 1 / 4 DMSO के समान मात्रा gramicidin () के बिना जोड़ने के लिए विलायक एकाग्रता सभी नमूनों में स्थिर रखने के लिए.

3. प्रतिदीप्ति साधन की स्थापना

  1. हम तापमान नियंत्रण के साथ एक एप्लाइड Photophysics SX.20 रोका प्रवाह spectrofluorometer उपयोग प्रतिदीप्ति शमन की दर को मापने के.
  2. समय से आगे एक घंटे पर उपकरणों मुड़ें गर्म अप के लिए अनुमति. घटक हैं: कंप्यूटर, इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रण इकाई, पानी (दोनों कूलर और हीटर) स्नान, दीपक बिजली की आपूर्ति और नाइट्रोजन टैंक.
  3. रिकॉर्डिंग प्रो - एसएक्स सॉफ्टवेयर डेटा का उपयोग कर शर्तों को सेट करें.
  4. / 1 1 उत्तेजना के लिए monochromator उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 352 एनएम और भट्ठा चौड़ाई apertures के सेट.
  5. Λ = 455 एनएम उत्सर्जन रिकार्ड उच्च पास फिल्टर का प्रयोग करें.
  6. "दबाव पकड़ो" सेटिंग है, जो साधन करने के लिए सक्षम बनाता है रिकॉर्डिंग के दौरान नाइट्रोजन दबाव बनाए रखने और इस तरह से पहले कुछ मिसे के दौरान दबाव दोलनों (और रिकॉर्डिंग कलाकृतियों) रोकता का उपयोग करें.
  7. "तिवारी सेटमुझे 5000 के लिए "अंक" 1 एस और ".
  8. दोहराने बॉक्स का उपयोग करें और दोहराता की संख्या समायोजित करने के लिए, आम तौर पर हम बफर और पेय रन के लिए 9 और 13 दोहराता उपयोग, क्रमशः.
  9. जल स्नान का तापमान 25 से सेट किया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस, तापमान एसएक्स सॉफ्टवेयर में निगरानी की जानी चाहिए.
  10. ड्राइव 120 μL मात्रा सेट, जिसका अर्थ है कि हर बार साधन एक नमूना चलाता है, यह दो सिरिंजों के प्रत्येक से 60 μL घोला जा सकता है. इस वाद्य सेटअप के साथ, एक 120 μL मात्रा ≈ 1.2 एमएस के एक मरे हुए समय देता है.
  11. प्रतिदीप्ति डिटेक्टर पर है चींटियों liposome लगभग 8 उत्पादन के लिए उच्च वोल्टेज (लाभ) को समायोजित करें. एक मानक प्रयोगात्मक मिश्रण के लिए लाभ हो 400-420 वी. कुछ दवाओं फ्लोरोसेंट, ऐसी है कि वे प्रतिदीप्ति संकेत तर कर सकते हैं कर रहे हैं चाहिए. इन मामलों में, लाभ वोल्टेज / कम किया जाना चाहिए.
  12. हमेशा छोड़ दिया और सही सिरिंज में बफर / पेय सिरिंज में फ्लोरोसेंट नमूना लोड. अच्छी तरह भंवर सुनिश्चित करें कि सभी लोड करने से पहले liposomes युक्त नमूने, और पता है कि समय के साथ LUVs सिरिंज में आदी हो जाएगा.

4. एक प्रयोग करना

  1. साथ चींटियों लोड LUVs का एक नमूना तैयार करने के लिए या तो विलायक या यौगिक, और या तो ना - बफर या TL-पेय (50 मिमी 3 TlNO, 94 मिमी नैनो 3, 7.0 पीएच में 10 मिमी HEPES) के साथ मिलकर spectrofluorometer में लोड.
  2. 1.5 एमएल पतला प्रयोग करें समाधान चींटियों - Luv, के साथ या gramicidin बिना, पिछले दिन तैयार.
  3. वांछित एकाग्रता में यौगिक या नियंत्रण के लिए विलायक जोड़ें. एक न्यूनतम और सभी नमूनों भर में लगातार विलायक एकाग्रता रखें. सांद्रता किसी भी नए यौगिक (अज्ञात) के साथ समायोजित किया जा करने के लिए वांछित रेंज खुराक - प्रतिक्रिया प्राप्त करने की आवश्यकता होगी. 25 पर 10 मिनट के लिए सेते ° C अंधेरे में.
  4. भंवर नमूना Luv और बाएँ सिरिंज में लोड. सही सिरिंज में ना - बफर या TL-पेय लोड.
  5. अच्छी तरह से दोनों नमूनों से सीरिंज वापस और आगे धकेलने के द्वारा हवाई बुलबुले को दूर.
  6. सुनिश्चित करें कि दोनों सीरिंज वाल्व बंद करने से पहले समान रूप से भरी हुई हैं. असमान लोड हो रहा है समाधान के पूर्व मिश्रण में परिणाम इससे पहले कि वे रिकॉर्डिंग कक्ष तक पहुंच जाएगा.
  7. बहुत पहला नमूना के लिए, ना - बफर के साथ प्रतिदीप्ति रिकॉर्ड, 4 बार दोहराने के लिए, आवश्यक के रूप में उच्च वोल्टेज (लाभ) को समायोजित करने के लिए, और 5 बार दोहराएँ.
  8. शेष नमूने ना - बफर के साथ रिकॉर्ड 9 दोहराता के लिए.
  9. TL-पेय और रिकॉर्ड 13 दोहराता साथ ना बफर बदलें.
  10. पानी से कुल्ला और अगले नमूने के साथ जारी है. के रूप में नियंत्रण हम साथ नमूने का उपयोग करें: विलायक के साथ दोनों gramicidin और विलायक के साथ कोई gramicidin और अधिकतम यौगिक एकाग्रता के साथ कोई gramicidin और,.

5. विश्लेषण डेटा

  1. विश्लेषण कंप्यूटर के लिए परिणाम स्थानांतरण. विश्लेषण करने के लिए सभी डेटा Matlab में पढ़ें. प्रत्येक नमूने के लिए, सभी बफर और पेय दोहराता में पढ़ा है, प्रत्येक मामले में पहले चार को छोड़कर के रूप में उन मिश्रण कलाकृतियों होते हैं. 120 μL के एक ड्राइव मात्रा मान लिया जाये कि यह थोड़ी कम से कम चार पूरी तरह से बंद कर दिया प्रवाह टयूबिंग से पिछले मिश्रण स्पष्ट शॉट्स लेता है.
  2. सभी नमूनों के लिए बफर दोहराता बहुत समान होना चाहिए. अगर वहाँ प्रतिदीप्ति संकेत है, जो परिसर एकाग्रता पर निर्भर करता है में एक महत्वपूर्ण बदलाव है, तो यौगिक ही फ्लोरोसेंट हो सकता है और यह नमूने सामान्य से पहले पहले इस अतिरिक्त प्रतिदीप्ति संकेत घटाना आवश्यक हो सकता है हो सकता है.
  3. मैन्युअल निशान के माध्यम से जाओ और "बुरा" दोहराता निकालने के लिए: मिश्रण कलाकृतियों और / या बुलबुले के कारण बहु exponentiality से spikes या विचलन युक्त दोहराता.
  4. प्रत्येक नमूना के लिए बफर दोहराता की औसत शुरू मूल्य पेय दोहराता सामान्यकरें. दृश्य के लिए एक ग्राफ में सभी नमूनों के औसत का मिश्रण.
  5. कोई gramicidin के साथ दर्ज निशान सभी समान होने चाहिए और लगभग कोई प्रतिदीप्ति शमन दिखाने, vesicles bilayer आठ के माध्यम से Tl के रिसाव + धीमी गति से होने के कारण प्रतिदीप्ति संकेत में एक धीमी गति से कमी हो सकता है. यदि कोई gramicidin और कोई आपरिवर्तक के साथ नमूना महत्वपूर्ण शमन से पता चलता है, तो vesicles खराब है और नहीं किया जाना चाहिए आगे. यदि कोई gramicidin लेकिन आपरिवर्तक के साथ नमूने महत्वपूर्ण शमन दिखाने के लिए, तो आपरिवर्तक इस हद तक है कि यह fluorophore या पेय bilayer पार करने के लिए अनुमति देता है vesicles bilayer perturbs.
  6. यदि यौगिक लिपिड bilayer गुण बदल, के रूप में gramicidin चैनलों द्वारा लगा, प्रतिदीप्ति समय बेशक दिख बदल जाएगा.
  7. प्रत्येक नमूना के लिए, एक बढ़ाकर घातीय एक समीकरण 4 जैसे) पहले 2-100 व्यक्तिगत दोहराता की सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति शमन वक्र के एमएस और दर करने के लिए फिट है चित्रा 2 42 एमएस पर गणना की थी. औसत और मानक विचलन के सभी व्यक्तिगत दोहराता से किसी दिए गए नमूने के लिए गणना कर रहे हैं.
  8. अंत में, निकटतम समय में नियंत्रण नमूना है कि gramicidin और आपरिवर्तक नहीं है के लिए सामान्य से बुझाना दर में रिश्तेदार परिवर्तन का निर्धारण करते हैं.

6. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1: प्रतिदीप्ति परख बुझाना आधारित अनिवार्य लिपिड bilayer गुणों में परिवर्तन का पता लगाने के लिए छोड़ दिया. शीर्ष: एक ज़ूम में अधिक चींटियों 3 नैनो के अंदर और 3 नैनो प्लस TlNO पर 3 बाहर के साथ एक एकल लिपिड पुटिका पर . शीर्ष सही: प्रतिदीप्ति (ऊपर से नीचे के रूप) पेय के बिना चींटियों - भरा vesicles का उपयोग कर, पेय के साथ पेय और पूर्व 87, 260 और 780 एनएम के gramicidin के साथ doped के साथ दर्ज संकेत. नीचे: बंद कर दिया प्रवाह के मिश्रण का चैम्बर के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व.

चित्रा 2
चित्रा 2: एक प्रो - डेटा एसएक्स विभिन्न प्रयोगात्मक स्थापना के विवरण में संदर्भित पैनल illustrating सॉफ्टवेयर से स्क्रीन शॉट.

चित्रा 3
चित्रा 3: ना बफर के साथ चींटियों लोड LUVs से प्रतिदीप्ति संकेत के एकाधिक दोहराने determinations पहले चार दोहराता हमेशा की तरह, अपवर्जित कर रहे हैं के रूप में वे मिश्रण कलाकृतियों होते. टयूबिंग मिश्रण सेल नमूना सीरिंज को जोड़ने परिभाषित मात्रा है, इसलिए पहले कुछ दोहराता हमें क्या टयूबिंग में पहले था पढ़ने देंगे: 1 दोहराने और 2, 3 दोहराने के लिए पानी और नमूने के कुछ संयोजन के लिए पानी, 4 दोहराने, शेष को दोहराता के लिए और सिर्फ नमूना के लिए ज्यादातर नमूना.

चित्रा 4
चित्रा 4: ना - बफर के साथ और TL-पेय के साथ चींटियों लोड LUVs से प्रतिदीप्ति संकेत के एकाधिक दोहराने determinations के पहले चार दोहराता दोनों स्थितियों से हटा दिया गया है. इसके अतिरिक्त, TL-पेय माप के लिए, 8 कलाकृतियों, सबसे अधिक संभावना हवाई बुलबुले के कारण हटाया जा जरूरत दोहराएँ.

चित्रा 5
चित्रा 5: capsaicin (कैप) के चींटियों प्रतिदीप्ति शमन के समय कोर्स पर प्रभाव (ए) एक एस पर सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति संकेत, ग्रे डॉट्स सभी दोहराता है (n> 5 हालत के प्रति) से परिणाम निरूपित, लाल लाइनों की औसत निरूपित दोहराता है. (बी) के पहले 100 एमएस, ग्रे डॉट्स प्रत्येक शर्त के लिए एक एकल दोहराने से परिणाम निरूपित, लाल लाइनों घातीय फिट बैठता है (2 - एमएस 100) फैला रहे हैं उन दोहराता है. stippled ब्लू लाइन 2 एमएस निशान, जो समय पर शमन की दर निर्धारित किया जाता है अर्थ. दोनों ए, बी और शीर्ष ट्रेस Tl के अभाव में परिणाम से पता चलता है +, अगले दो निशान GA के अभाव में परिणाम Tl साथ दिखाने ± कैप +, चार कम निशान के साथ 260 एनएम GA और Tl + जहां परिणाम बताते हैं संख्या सुक्ष्ममापी में [कैप] निरूपित. 0, 10, 30, और 90 सुक्ष्ममापी कैप, के रूप में एक बढ़ाकर घातीय दर से निर्धारित किया जाता है, के लिए शमन की दर 36 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 और 247 ± 27 (मतलब ± एसडी, n> 8) , क्रमशः.

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Discussion

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हम दवाओं और अन्य छोटे amphiphiles के bilayer संशोधित क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक तेजी से प्रतिदीप्ति आधारित परख प्रदर्शन किया है. कम्पाउँड कि bilayer गुणों को संशोधित करने के लिए एक अप्रत्यक्ष, nonspecific तरीके से झिल्ली प्रोटीन समारोह में परिवर्तन, संभवतः "लक्ष्य" दवा प्रभाव के लिए योगदान की संभावना है. परख bilayer गुणों में परिवर्तन 12 कि bilayer - फैले प्रोटीन से महसूस कर रहे हैं के लिए जांच के रूप में gramicidin चैनलों की शक्ति का लाभ उठाते है. प्रतिदीप्ति आधारित परख का उपयोग कर परिणाम प्राप्त एकल चैनल GA 12 प्रयोगों से परिणाम के साथ अच्छे समझौते में हैं, यह दर्शाता है कि इस विधि में अच्छी तरह के रूप में यौगिक पुस्तकालयों स्क्रीनिंग के लिए यंत्रवत अध्ययनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. परख की वर्तमान विन्यास का उपयोग हम यौगिकों के एक दिन दर्जनों, एकल चैनल दृष्टिकोण का उपयोग कर जो संभव से एक - दो परिमाण उच्च throughput के आदेश का परीक्षण कर सकते हैं. वहाँ कोई मौलिक दर सीमित प्रतिदीप्ति आधारित परख में कदम, जिसका अर्थ है कि यह सच उच्च throughput मोड में चलाने के लिए बढ़ाया जा सकता है. यह संभव है परख इलेक्ट्रोलाइट समाधान भिन्न और / या 'LUVs के लिए अलग लिपिड रचना का उपयोग करें. यह कि कुछ लिपिड रचनाओं अलग जब सूखे, तेजी से विलायक विनिमय प्रणाली / जलयोजन 7 चरणों सुखाने के बजाय आवश्यकता होती है सकते हैं टिप्पण लायक है.

यह अस्पष्ट बनी हुई है कि क्या वहाँ दवा सुराग के lipophilicity बढ़ाने और दवा 10,11,17 के विकास में बढ़ती उदासीनता और, यदि हां, तो क्या अंतर्निहित तंत्र (ओं) के बीच एक कारण रिश्ता है ? फिर भी, क्योंकि झिल्ली प्रोटीन करने के लिए अपने झिल्ली 2 वातावरण में परिवर्तन द्वारा विनियमित किया जा करते हैं, यह परीक्षण है कि क्या amphiphilic दवाओं और दवा सुराग प्रासंगिक लिपिड bilayer गुणों को बदलने के विवेकपूर्ण और सांद्रता क्या होगा, यदि हां, तो? Amphiphile लिपिड bilayer सोखना जलीय चरण खलाना, इसलिए प्रासंगिक एकाग्रता जलीय चरण में मुफ्त एकाग्रता जो प्रणाली में नाममात्र एकाग्रता, जैसे 6,9,16 से कम परिमाण के आदेश हो सकता है. यदि एक अणु वांछित प्रभाव (जैविक) सांद्रता में होते हैं जहां यह गुण बदल bilayer, यह महत्वपूर्ण हो जाता है "गैर विशिष्ट" के बीच अंतर है, झिल्ली प्रोटीन समारोह में bilayer की मध्यस्थता में परिवर्तन, के रूप में प्रत्यक्ष प्रभाव के कारण (उच्च आत्मीयता विरोध ) एक या एक से अधिक लक्ष्य प्रोटीन के लिए बाध्य. एक दवा नेतृत्व के bilayer संशोधित प्रवृत्ति, पारंपरिक उच्च throughput स्क्रीनिंग के माध्यम से की खोज की, को जानने का है इसलिए इसके आगे के विकास के बारे में निर्णय के लिए महत्वपूर्ण होने की संभावना है.

कोई amphiphile कुछ एकाग्रता में कुछ bilayer संपत्ति बदल जाएगा. एकाग्रता क्या, और bilayer गुणों में परिवर्तन कर रहे हैं (bilayer फैले) झिल्ली प्रोटीन लगा: प्रमुख विचार इसलिए बन? यहाँ हम gramicidin transbilayer 15 dimerization द्वारा चैनलों के रूप में की क्षमता का दोहन. यह उन लिपिड bilayers और bilayer एम्बेडेड प्रोटीन के बीच ऊर्जावान युग्मन के लिए उपयोगी जांच करता है, और की खोज है कि क्या छोटे अणुओं bilayer गुण है कि झिल्ली प्रोटीन द्वारा महसूस कर रहे हैं में परिवर्तन करने के लिए. परख तेजी से, विश्वसनीय और परिमाप्य है, और इसलिए दोनों biophysical अध्ययन के लिए उपयुक्त है और संभावित bilayer perturbing प्रभाव के साथ दवाओं के लिए यौगिक पुस्तकालयों स्क्रीनिंग के लिए.

12 परख, परख प्रभावशीलता का सत्यापन, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एकल चैनल के साथ तुलना पर अतिरिक्त जानकारी के लिए देखें .

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Disclosures

है कि पांडुलिपि में वर्णित तरीकों को शामिल किया गया एक अनंतिम पेटेंट आवेदन दायर किया गया है. सह आविष्कारक HII और ओएसए हैं.

Acknowledgments

हम कई उत्तेजक विचार विमर्श के लिए माइकल जे ब्रूनो, Radda Rusinova और जॉन टी. बोरी धन्यवाद. एनआईएच, R01GM021342 और ARRA पूरक R01GM021342 35S1, और योशिय्याह Macy है, जूनियर, ओएसए फाउंडेशन से वित्तीय समर्थन, त्रिकोणीय मैं HII के लिए CMB कार्यक्रम, और परितारिका एल और Leverett एस Woodworth चिकित्सा वैज्ञानिक फैलोशिप और NIH MSTP अनुदान GM07739 आर.के. के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ANTS Invitrogen A-350
gramicidin Sigma-Aldrich G-5002
1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipid, Inc 850398C
Mini-Extruder kit Avanti Polar Lipid, Inc 610000
PD-10 Desalting column Sigma-Aldrich 54805

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References

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छोटे अणुओं लिपिड bilayer गुण को संशोधित करने के लिए संभावित निर्धारण के लिए, Gramicidin आधारित प्रतिदीप्ति परख
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Ingólfsson, H. I., Sanford, R. L., Kapoor, R., Andersen, O. S. Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties. J. Vis. Exp. (44), e2131, doi:10.3791/2131 (2010).More

Ingólfsson, H. I., Sanford, R. L., Kapoor, R., Andersen, O. S. Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties. J. Vis. Exp. (44), e2131, doi:10.3791/2131 (2010).

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