Summary
단일 세포 분석 레이저 박리 전기 분무 이온화 (LAESI) 질량 분광법에 대한 세포 샘플을 날카롭게 광섬유를 사용하여 대기압에서 식물과 동물 세포의 대량 분석법에 의해 수행됩니다.
Abstract
단일 세포에서 biochemicals 분석 심지어 같은 세포 유형들이 생리적 조건 및 환경과 상호 작용에 따라 이기종 생화 학적 메이크업을 전시 세포 대사, 세포주기, 적응, 질병 상태 등을 이해하는 것이 중요합니다. 단일 세포의 biomolecules의 분석에 사용되는 질량 분석계 (MS)의 종래의 방법은 광범위한 샘플 준비에 의존하고 있습니다. 그들의 자연 환경과 다양한 샘플 처리에서 세포를 제거하면 세포 조성의 변화가 발생할 수 있습니다. 대기 이온화 방법은 자신의 모국어 환경에서 광범위한 샘플 준비없이 시료의 분석을 가능하게합니다. 1 2.94 μm의 파장에서 생물 학적 물질의 중간 적외선 (중간 IR) 레이저 절제에 따라 기술이 물이 갑자기 여기를 활용되는 단계 결과 폭발. 이러한 레이저 박리 전기 분무 이온화 (LAESI)과 대기압 적외선 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 이온화 (AP IR - 든)와 같은 중간 IR 레이저 방사에 기반이 대기 이온화 기술을 성공적으로 직접 분석 물을 수있는 능력을 증명하고있다 대기압에서 풍부한 조직 및 biofluids. LAESI 대부분 이온을 생산하기 위해 고도로 청구 전기 분무의 방울로 샘플 coalesces에서 중성 미립자 물질로 구성되어 중반 IR 레이저 박리 플륨에서 3-11. 최근, 단일 세포의 중간 IR 절제가 새겨져 광섬유를 통해 중반 IR 방사를 제공함으로써 수행되었다. 이 절제에서 생성된 깃털은 LAESI - MS에 의해 하나의 세포에있는 다양한 metabolites의 분석을 가능하게 전기 분무에 의해 postionized되었습니다. 12이 문서는 LAESI - MS를 사용하여 단일 세포 분석을위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 제출 비디오 알리움 cepa 전구의 피부에서 단일 표피 세포의 분석을 보여줍니다. 시스템의 개략도는 그림 1에 표시됩니다. 세포에서 단일 세포 절제와 LAESI 질량 스펙트럼의 대표 예는 그림 2에 제공됩니다.
Protocol
1. 광학 부품
- 레이저 박리 전기 분무 이온화 (LAESI) 질량 분석계 (MS)에 대한 레이저 박리는 2.94 μm의 파장에서 5 NS 레이저 펄스에 의해 생산됩니다. ND에 의해 주도 조정할 수 광 파라메 트릭 발진기 : YAG 레이저 (Opolette 100, Opotek 주식 회사, 칼스 배드, CA)는이 연구에서 절제에 사용됩니다. 반복 속도는 5 Hz에서 100 사이의 선택됩니다. 이것은 직접적인 노출시 눈 또는 피부에 심각한 영구적인 손상을 일으킬 수있다는 것을 클래스 IV 레이저입니다. 레이저 빔의 확산 반사는 피부 또는 눈에 유해한 수 있습니다. 보호를위한 적절한 레이저 고글을 착용.
- 게르마늄 이산화 기반의 유리로 만든 광섬유는 적외선 섬유 시스템즈 (실버 스프링, MD)에서 얻은 것입니다. 이 Hytrel 있으며 섬유에 코팅이 끝나는에서 그들을 제거하기 위해 다음 지침을 따르십 polyimide 경우. 열 1 - 메틸 - 2 - pyrrolidinone 130-150 ° C로 퓸 후드 인치 섬유가 약 1 분 또는 코팅이 부드럽게 시작까지 보지이 액체에 스트립하려는 종료 딥. 메탄올 또는 잠시 이소프로판올로 부드럽게 코팅 찍어 및 보푸라기가없는 냅킨으로 남아있는 코팅을 닦아. 코팅을 제거 후, 클리브 점수 부드럽게 그들을 욕하는게하여 사파 블레이드 (KITCO 광섬유 광학, 버지니아 비치, VA)과 섬유질이 모두 끝납니다.
- 1퍼센트 (V / V) 질산의 산성 (시약 등급) 솔루션, 섬유 팁의 화학적 에칭 한쪽 끝을 원하는 선명도를 얻을 수 있습니다. 수직 최초의 연락 후 300-500 μm의 깊이에 산성 용액에 섬유를 선택한 끝을 담가. 에칭의 약 15 분 후에 팁 그러다가 자연 산성 표면에서 분리합니다. 곡률 ~ 15 μm의 범위와 날카롭게 섬유 팁이 발생합니다. 모든 산성 찌꺼기를 제거하는 탈이온수와 린스.
- micromanipulator에 섬유 (MN - 151, Narishige, 도쿄, 일본)의 에칭 종료를 탑재하고 효율적인 에너지 증착을위한 세포 표면의 근접을 (~ 20 μm의) 가까이에 그것을 가지고.
- 맨 섬유 척 (BFC300, 시스키유 공사 그란츠 패스, OR)에 의해 광섬유의 비 에칭 끝을 잡고. 광학 정렬 들어, 섬유 척은 다섯 축 번역사 (BFT - 5 시스키유 공사 보조금 패스, OR)에 장착됩니다. 레이저 에너지는 (0.5-1 MJ)의 비 에칭 엔드에 평철의 칼슘 플루오르 또는 반사 코팅 ZnSe 렌즈 (적외선 광학 제품, 파밍데일, NY)의 광선을 집중하여 섬유에 결합됩니다. 보호 골드 미러 (PF10 - 03 - M01, Thorlabs, 뉴턴, NJ) 초점 렌즈에 중반 IR 레이저 광선을 조종하는 데 사용됩니다.
2. 전기 분무 설정
- 전도성 perfluoroelastomer의 물미, 피팅, 튜브 슬리브, 바늘 포트 (각각 예를 들어, U - 435, M215, F - 331Nx, F - 242x, 9013, IDEX 건강 & 사이언스와 금속 노조 : 전기 분무 시스템은 다음과 같은 구성 요소를 사용하여 건설 수 있습니다 오크 하버, WA)뿐만 아니라 융합 실리카 튜브 (예 : CT360 - 100 - 50-5, 뉴 목적 주식 회사, 워번, MA). 권장 에미터는 스테인레스 스틸로 만들어진 및 50 μm의 아이디 (예 : MT320 - 50 - 5 - 5, 새로운 목표 주식 회사, 워번, MA)와 테이퍼 팁 가지고있다.
- 전기 분무에 대한 0.1 % 초산 (V / V)와 50 % 메탄올 용액을 준비합니다. 솔루션을 사용하여 주사기 펌프 (하버드 장치, 홀리스튼, MA)에 의해 200-300 NL / 분 속도로 펌핑이다, 예를 들어, 500 μl 주사기 (81222, 해밀턴 회사, 리노, 네바다).
- 지속적으로 전기 분무를 생성하기 위해 규제 전원 공급 장치 (PS350, 스탠포드 연구 시스템 병원, 서니 베일, CA)에 의해 금속 노조에 2800과 3000 V 사이에 높은 전압을 적용합니다. 모든 전기 연결이 안전하고 적절하게 접지 차폐와 차폐된 있는지 확인합니다. 노출된 높은 전압 직접 접촉 감전이 발생할 수 있습니다.
3. 샘플 처리
- 적절한 소스에서 살아있는 조직이나 세포 샘플을 확보하고 그들과 같이 분석하기 전에 권장 유지. 이 예제에 대한 알리움 cepa 구근은 지역 상점에서 구입했다. 수술 메스에 의해 길이 방향 전구 컷. 규모의 몇 cm 세그먼트는 스트립에 sectioned되었습니다. 안쪽 표피 조직의 손상 monolayer가 해제 벗겨 있습니다.
- 표피의 젖은 표면은 미리 청소 유리 현미경 슬라이드에 조직을 마운트하는 데 사용됩니다. 위치에 대한 3 축 번역 무대에 탑재된 범용 플레이트 홀더 (FP01, Thorlabs 주식 회사, 뉴턴, NJ)의 슬라이드를 잡아. 즉시 세포 저하를 방지하기 위해 시료를 장착 후 질량 스펙트럼을 취득.
4. 시각화 시스템
- 두 장거리 현미경은 분석을 위해 세포를 선택하고 날카롭게 섬유 팁 및 세포 표면 사이의 거리를 유지하는 데 사용됩니다. 후자는 표면에서 측정된 15 ° -30 각도에 따라 마운트됩니다. 이 시스템은 알 이루어져5 배 무한대로 긴 사연이 거리 비디오 현미경 (7x 정밀 줌 광학, 에드먼드 광학, 배링턴, NJ) CCD 카메라 (말린 F131, 관련 비전 기술을 갖춘 객관적인 렌즈를 (배 M 계획 APO, Mitutoyo (주), 가나가와, 일본) 수정 , 모니터링 및 이미지 캡처를위한 Stadtroda, 독일).
- 두 번째 비디오 현미경은 상단의 세포를 시각화하기 위해 시료 표면에 직각으로 장착됩니다. 이 시스템은 절제와 분석을 위해 선택한 셀 위에 광섬유 팁을 정렬 시각적인 피드백을 제공합니다. 그것은 10X 무한 장착되어 7x 정밀 줌 광학 (에드먼드 광학, 배링턴, NJ),로 구성되어 긴 작동 거리의 객관적인 렌즈 (10X M 계획 APO, Mitutoyo (주), 가나가와, 일본)와 CCD 카메라를 수정.
5. 질량 스펙트럼의 취득
- 레이저, 전기 분무 및 질량 분석기, 예를 들어, quadrupole 시간의 비행 시스템 (Q - TOF 프리미어, 워터스, 밀퍼드, MA)를 켭니다. 절제 명소 및 전기 분무의 서로 상대적인 방출 및 최대 이온 농도를 달성하기 위해 질량 분석계의 구멍의 위치를 조정하여 LAESI 이온 소스의 지오메 트리를 최적화합니다.
- 최상위보기 시각화 시스템을 사용하여 분석에 관심있는 셀을 선택합니다. 선택 후, 직접 광섬유의 끝에 날카롭게 아래 선택한 셀을 가져 샘플 무대를 이동합니다. 사이드보기 현미경을 사용하면 ~ 20 μm의에 대한 팁 - 투 - 셀 표면 거리를 다시 조정.
- 에칭 섬유 팁 통해 선택한 셀 발사 레이저 펄스. 세포 벽 및 미립자 물질의 형태로 세포질의 방출의 천공이 결과를. 전기 분무에 의해 postionization 후 생산 이온은 질량 분석계 및 질량 스펙트럼에 의해 저장됩니다이 기록됩니다.
- 데이터 수집 후, 레이저, 전기 분무 및 대기 모드에서 질량 분석계를 넣어하거나 전원을 끕니다. ablated A. 유지 가벼운 현미경으로 관찰하기 위해 선택 cepa 조직 샘플.
6. 대표 결과
세포 벽 및 LAESI 질량 스펙트럼의 컬렉션의 파열에 단세포 결과의 성공적인 절제. 실패한 실험은 보통없이 절제 및 / 또는 없음 대량 스펙트럼 결과. 데모를 위해, 우리는 A.의 단일 내장 표피 세포의 LAESI - MS 분석에서 결과를 제시 cepa 전구. 그림 2A는 세포의 샘플링 후 대표적인 광학 현미경 이미지를 보여줍니다. 세포 벽이 천공하고 천공의 범위는 이웃 세포와 경계에 의해 제한됩니다. 인접한 세포가 손상 될 것 같습니다. 그림 2B는 세포에서 생산되는 대표 LAESI 질량 스펙트럼을 보여줍니다. 이온의 다양한는 A.에서 감지 cepa 세포들이 정확하게 대중을 기반으로, 동위 원소 분포 패턴, 그리고 경우에, 탠덤 질량 스펙트럼, 그들은 미정 내생 metabolites에 할당됩니다. 하나의 세포에서 발견 이온은 여러 세포의 기존 LAESI - MS하여 동일한 조직의 분석에서 관찰된 것과 비슷 13.
그림 1. LAESI - MS에 의해 단일 세포 분석 개략도. 중간 IR 레이저 펄스는 광섬유로 결합하여 유리 슬라이드에 배치 샘플로 전달됩니다. 날카롭게 섬유 팁는 대상 세포에 빛을 초점을 맞추고 있으며 예금 에너지 셀을 없어지는. 생산 절제 플륨 (빨간색 점)는 샘플 특정 이온의 생산의 결과 방울이 뭉쳤다 전기 분무 플륨 (검은 점) (녹색 점들)와 병합됩니다. 이러한 이온 분석 및 질량 분석기 (MS)에 의해 감지됩니다. 두 장거리 비디오 현미경, 현미경 1 현미경 2, 섬유 팁 및 세포 표면 사이의 거리를 모니터링하고 분석을위한 세포, 각각을 선택하기 위해 이용됩니다.
A.의 단일 표피 세포에 그림 2A가. 절제 표시 cepa 전구. 인접한 세포가 보이는 피해를 전시하지 않고 이후 개별적으로 분석할 수 있습니다.
단일 A.의 절제에 해당하는 그림 2B. 질량 스펙트럼 cepa 표피 세포는 기본 및 보조 metabolites의 존재를 보여줍니다.
Discussion
세포 세포질과 세포 벽이나 막의 인장 강도의 수분 함량은 LAESI - MS 분석하는 동안 단일 세포의 박리를 관할하는 중요한 요소가됩니다. 레이저 fluence은 서로 다른 세포 유형의 절제 임계값에 도달하기 위해 조정되어야합니다. 전달 레이저 fluence은 레이저 펄스의 에너지와 섬유 팁 및 세포 표면 사이의 거리에 따라 달라집니다. 단일 세포 분석을하는 동안 주변 세포의 섭동을 최소화하는 것이 중요합니다. 절제 임계값에 레이저 에너지를 유지하면 인접 세포에 대한 분석의 효과를 제한합니다.
잠재적인 응용 프로그램 중 하나는 MS의 화학 이미징을위한 자연 체적 픽셀 (voxels)로 단일 세포를 사용하고 있습니다. 인공 자주 직사각형 격자에 대한 데이터를 수집에 비해 한 번에 조직 세포 하나의 화학 화상은 세포 사이의 생화 학적 상호 작용의 공간적 조직을 유지하기 위해 더 많은 가능성이 높습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 다음과 같은 기관에서 재정 지원을 인정하고, 국립 과학 재단 (부여 0719232), 에너지 부 (부여 DEFG02 - 01ER15129), WM 켁 재단 (부여 041904), 그리고 조지 워싱턴 대학 리서치 향상 기금. 저자는 아낌없이 마크 E. 리브스와 조지 워싱턴의 호안 A. 호프만에 의해 섬유 에칭에 관한 프로토콜에 대한 초기 논의에 대한 적외선 광섬유 시스템 (실버 스프링, MD)뿐만 아니라 제공한 GeO2 기반의 광학 섬유에 대한 감사 대학. 저자는 또한 프로토콜 찍고하는 동안 그녀의 도움 제시카 A. Stolee 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Fluka | 45727 | |
| Methanol | Fluka | 65548 | |
| 1-methyl-2-pyrrolidinon | Sigma-Aldrich | M79603 | |
| Water | Fluka | 39259 |
References
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