Summary
Enda cell analys görs av masspektrometri på växt-och djurceller vid atmosfärstryck genom att använda en vass optisk fiber för att prova de celler för laser ablation elektrospray jonisation (LAESI) masspektrometri.
Abstract
Analys av biokemiska i enskilda celler är viktig för att förstå cellens ämnesomsättning, cellcykeln, anpassning, säger sjukdom etc. Även samma cell typerna uppvisar heterogena biokemiska makeup beroende på deras fysiologiska förutsättningar och samspel med omgivningen. Konventionella metoder för masspektrometri (MS) används för analys av biomolekyler i enskilda celler är beroende av omfattande provberedning. Ta bort celler från sin naturliga miljö och omfattande prov-behandling kan leda till förändringar i cellens sammansättning. Omgivande jonisering metoder gör det möjligt att analysera prover i deras naturliga miljö och utan omfattande provberedning. 1 De tekniker som bygger på mitten av infraröda (mid-IR) laser ablation av biologiskt material på 2,94 ìm våglängd utnyttja plötsliga excitation av vatten som resultat i fas explosionen. 2 Omgivande jonisering tekniker som bygger på mid-IR laserstrålning, som laser ablation elektrospray jonisation (LAESI) och atmosfäriskt tryck infraröd matris-assisterad laser desorption jonisering (AP IR-MALDI), har framgångsrikt visat förmåga att direkt analysera vatten- rika vävnader och biofluids vid atmosfärstryck. 3-11 I LAESI mitten av IR-laser ablation plym som mestadels består av neutrala partiklar från provet sammanbinds med högt laddade elektrospray droppar för att producera joner. Nyligen var i mitten av IR-ablation av enskilda celler som utförs genom att leverera i mitten av IR-strålning genom en etsad fiber. Plymen genereras från denna ablation var postionized av en elektrospray möjliggöra analys av olika metaboliter i enstaka celler med LAESI-MS. Beskriver detaljerat protokoll för enskild cell analys med LAESI-MS 12 denna artikel. De presenterade videon visar en analys av en enda epidermal cell från huden på en Allium cepa glödlampa. Den schematiska av systemet visas i Figur 1. Ett representativt exempel på en enda cell ablation och en LAESI masspektrum från cellen finns i figur 2.
Protocol
1. Optiska komponenter
- Laser ablation för laser ablation elektrospray jonisation (LAESI) masspektrometri (MS) är producerad av en 5 ns laserpuls på 2,94 ìm våglängd. En avstämbara optisk parametrisk oscillator som drivs av en Nd: YAG laser (Opolette 100, Opotek Inc., Carlsbad, CA) används för ablation i denna studie. Den pulsrepetitionsfrekvens väljs mellan 5 och 100 Hz. Detta är en klass IV-laser som vid direkt exponering kan orsaka allvarliga bestående skador på ögon eller hud. Den diffusa reflektion av laserstrålen kan också vara farligt för huden eller ögat. Använd en lämplig laser goggle för skydd.
- Den optiska fiber gjord av germanium koldioxid-baserade glaset har erhållits från Infraröd Fiber Systems, Inc. (Silver Spring, MD). Om det finns Hytrel och polyimid beläggningar på fiber följa anvisningarna nedan för att ta bort dem från ändarna. Heat 1-metyl-2-pyrrolidinone att 130-150 ° C i ett dragskåp. Doppa fibern slutar du vill remsan i denna vätska i ca 1 min eller tills färgen börjar mjukna och lossnar. Doppa mjuka beläggningen till metanol eller isopropanol i en minut och torka bort eventuell kvarvarande beläggning med en luddfri servett. Efter att beläggningen, klyva båda ändarna av fiber med en safir blad (Kitco fiberoptik, Virginia Beach, VA) genom att göra poäng och försiktigt knäppa dem.
- För att uppnå önskad skärpa, kemiskt etch ena änden av fibern spetsen med 1% (v / v) salpetersyra (reagenskvalitet) lösning. Vertikalt doppa den valda änden av fibern i den sura lösningen till ett djup på 300 till 500 ìm efter den första kontakten. Efter ca 15 minuters etsning, kommer spetsen lossnar spontant från syran ytan. Detta resulterar i en skärpt fiberspetsen med ~ 15 ìm krökningsradien. Skölj med avjoniserat vatten för att avlägsna sura rester.
- Montera etsade slutet av fibrer på en mikromanipulator (MN-151, Narishige, Tokyo, Japan) och föra den till närhet (~ 20 mikrometer) på cellytan för effektiv energi nedfall.
- Håll icke-etsade slutet av optisk fiber med en naken fiber chuck (BFC300, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR). För optisk justering är fiber chucken monteras på en fem-axlig översättare (BFT-5, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR). Lasern energi (0,5 till 1 MJ) är kopplad till den fiber genom att fokusera strålen av ett PLANKONVEX kalciumfluorid eller antireflex belagda ZnSe lins (Infraröd optik, Farmingdale, NY) på sin icke-etsade slut. Skyddad guld speglar (PF10-03-M01, Thorlabs, Newton, NJ) används för att styra mitten av IR-laser på att fokusera linsen.
2. Elektrospray Setup
- Det elektrospray Systemet kan konstrueras med följande komponenter: metall förening med ledande perfluorelastomer holk, rördelar, slangar ärm, nål-port (t.ex. U-435, M215, F-331Nx, F-242x, 9013, respektive IDEX Hälsa & Sciences, Oak Harbor, WA) samt kvarts slang (t.ex. CT360-100-50-5, nya mål Inc., Woburn, MA). Den rekommenderade emitter är tillverkad av rostfritt stål och har en avsmalnande spets med en 50 ìm ID (t.ex. MT320-50-5-5, nya mål Inc., Woburn, MA).
- Förbered 50% metanol lösning med 0,1% ättiksyra (v / v) för elektrospray. Lösningen pumpas med en hastighet på 200 till 300 nl / min med en sprutpump (Harvard Apparatur, Holliston, MA) med hjälp av t ex ett 500 l spruta (81.222, Hamilton Company, Reno, NV).
- Applicera hög spänning mellan 2800 och 3000 V för att metallen unionen genom en reglerad strömförsörjning (PS350, Stanford Research Systems Inc, Sunnyvale, CA) för att generera en stadig elektrospray. Se till att alla elektriska anslutningar är trygga och skyddade med skärmning jordad. Direkt kontakt med utsatta högspänning kan orsaka elektriska stötar.
3. Provhantering
- Skaffa den levande vävnad eller cell prov från en lämplig källa och hålla dem så rekommenderas före analysen. Den Allium cepa glödlampor för denna demonstration hade köpts från en lokal butik. Skär en glödlampa längden av en kirurgisk skalpell. Några centimeter segment av en skala var uppställd i ett band. En intakt monolager av det inre epidermal vävnad är skalade bort.
- Den våta ytan av överhuden används för att montera vävnaden på ett förrengöras glas objektglas. Håll bilden av en generell hållare (FP01, Thorlabs Inc., Newton, NJ) monterad på en treaxlig översättning scen för positionering. Förvärva masspektra omedelbart efter montering av prov för att förhindra cellens nedbrytning.
4. Visualiseringssystem
- Två långa avstånd mikroskop används för att markera cellerna för analys och för att bibehålla avståndet mellan vässade fiberspetsen och cellytan. Denna är monterad i 15 ° -30 ° vinkel mätt från ytan. Detta system består av alOng avstånd video mikroskop (7x precision zoom optik, Edmund Optics, Barrington, NJ) med en 5x oändlighet korrigerat objektiv (M Plan Apo 5x, Mitutoyo Co, Kanagawa, Japan) utrustad med en CCD-kamera (Marlin F131, Allied Vision Technologies , Stadtroda, Tyskland) för att övervaka och ta bilder.
- Den andra videon Mikroskopet är monterad i en rät vinkel mot provets yta att visualisera celler från toppen. Detta system ger visuell feedback för att justera fiberspetsen över cellen valts för ablation och analys. Den består av en 7x precision zoom optik (Edmund Optics, Barrington, NJ), utrustad med en 10x oändlighet korrigerad långa arbetsdagar lins avstånd mål (M Plan Apo 10x, Mitutoyo Co, Kanagawa, Japan) och en CCD-kamera.
5. Förvärv av masspektra
- Slå på laser, elektrospray och masspektrometer, t.ex. en quadrupol time-of-flight system (Q-TOF Premier, Vatten, Milford, MA). Optimera geometri LAESI jonkälla genom att justera läget för ablation plats och elektrospray sändare i förhållande till varandra och öppning av masspektrometer för att uppnå maximal jon intensiteter.
- Markera cellen av intresse för analys med hjälp av topp-view-visualisering systemet. Efter valet, flytta provet scenen för att få den markerade cellen direkt under slipade spetsen av optisk fiber. Använda sidan-view mikroskop justera spets-till-cell avstånd ytan ~ 20 mikrometer.
- Brand laserpulser på den markerade cellen genom etsade fiberspetsen. Detta resulterar i perforeringen på cellväggen och utmatning av cytoplasman i form av partiklar. Efter postionization av elektrospray, är producerade joner samlas in av masspektrometer och mass spektra registreras.
- Efter datainsamling, sätta laser, elektrospray och masspektrometer i vänteläge eller stänga av dem. Håll borttagen A. CEPA vävnadsprov för valfria observation av ljusmikroskop.
6. Representativa resultat
Lyckad ablation av en enda cell resultat i den spruckna cellväggen och insamlingen av en LAESI masspektrum. En misslyckad experiment resulterar vanligen i någon ablation och / eller ingen masspektrum. För demonstrationsändamål presenterar vi resultaten från LAESI-MS analys av en inbäddad enda epidermal cell i ett A. CEPA glödlampa. Figur 2a visar en representativ optisk mikroskopi bild efter provtagning av en cell. Cellväggen är perforerad och omfattningen av perforering begränsas av gränser med angränsande celler. Den angränsande celler verkar vara intakt. Figur 2b visar ett representativt LAESI masspektrum produceras från cellen. Ett brett utbud av joner upptäcks från A. cepa cellen och baserat på deras riktiga massorna, isotop mönster distribution, och i vissa fall, tandem mass spektra, de är preliminärt tilldelats endogena metaboliter. Jonerna detekteras från en enda cell var liknande dem som observerades i analysen av samma vävnad med konventionell LAESI-MS i flera celler. 13
Figur 1. Schematisk bild av en enda cell analys genom LAESI-MS. En mid-IR laserpuls är kopplad till en optisk fiber och levereras till provet placeras på glasplatta. Den vässade fiberspetsen fokuserar ljuset in i målcellen och deponerade energin spricker cellen. Den producerade ablation plym (röda prickar) slås samman med en electrospray plym (svarta prickar) dropparna sammansmälter (gröna prickar), vilket gav prov specifika jon produktion. Dessa joner analyseras och upptäcks av masspektrometer (MS). Två långa avstånd video mikroskop, Mikroskop 1 och Mikroskop 2, används för att övervaka avstånd mellan fiberspetsen och cellens yta och för att markera en cell för analys, respektive.
Figur 2a. Ablation märket på en enda epidermal cell i ett A. CEPA glödlampa. Den intilliggande celler inte uppvisar synliga skador och sedan kan analyseras separat.
Figur 2b. Masspektrum motsvarar ablation av en enda A. CEPA epidermala celler visar förekomsten av primära och sekundära metaboliter.
Discussion
Vatteninnehållet i cellens cytoplasma och draghållfasthet i cellväggen eller membran är kritiska faktorer som styr ablation av enskilda celler under LAESI-MS-analys. Lasern fluensen måste justeras för att nå ablation trösklar av olika celltyper. Den levererade laser fluens beror på energin i laserpuls och om avståndet mellan fiberspetsen och cellytan. Minimera störning av angränsande celler under en enda cell analysen är kritisk. Att hålla lasern energi vid ablation gränsvärden effekten av analysen av angränsande celler.
En av de potentiella tillämpningar använder enstaka celler som den naturliga volymetriska pixlar (voxlar) för kemisk avbildning av MS. Jämfört med att samla in data på en konstgjord ofta rutnät, är kemisk avbildning av en vävnad en cell i taget mer benägna att behålla den rumsliga organisationen av biokemiska interaktioner mellan celler.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna medger ekonomiskt stöd från följande institutioner, National Science Foundation (Grant 0.719.232), Department of Energy (Grant DEFG02-01ER15129), WM Keck (Grant 041.904) Foundation och George Washington University Research Enhancement fonden. Författarna är tacksamma för GeO2-baserade optiska fibrer generöst levereras av Infraröd Fiber Systems (Silver Spring, MD) samt för den inledande diskussionen om protokollet om fibern etsning av Mark E. Reeves och Joan A. Hoffmann av George Washington universitet. Författarna vill också tacka Jessica A. Stolee för hennes hjälp under videofilmning av protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Fluka | 45727 | |
| Methanol | Fluka | 65548 | |
| 1-methyl-2-pyrrolidinon | Sigma-Aldrich | M79603 | |
| Water | Fluka | 39259 |
References
- Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Ambient Mass Spectrometry. Science. 311, 1566-1570 (2006).
- Chen, Z. Y., Vertes, A. Early plume expansion in atmospheric pressure midinfrared laser ablation of water-rich targets. Physical Review E. E77, 036316-036316 (2008).
- Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. Atmospheric Pressure Molecular Imaging by Infrared MALDI. Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 79, 523-532 (2006).
- Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. Atmospheric Pressure Infrared MALDI Imaging Mass Spectrometry for Plant Metabolomics. Analytical Chemistry. 80, 407-420 (2007).
- Nemes, P., Vertes, A. Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 79, 8098-8106 (2007).
- Shrestha, B., Li, Y., Vertes, A. Rapid analysis of pharmaceuticals and excreted xenobiotic and endogenous metabolites with atmospheric pressure infrared MALDI mass spectrometry. Metabolomics. 4, 297-311 (2008).
- Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. Ambient Molecular Imaging and Depth Profiling of Live Tissue by Infrared Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 80, 4575-4582 (2008).
- Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81, 6668-6675 (2009).
- Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82, 982-988 (2010).
- Shrestha, B. Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry. Analyst. , Forthcoming (2010).
- Sripadi, P., Nazarian, J., Hathout, Y., Hoffman, E., Vertes, A. In vitro analysis of metabolites from the untreated tissue of Torpedo californica electric organ by mid-infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Metabolomics. 5, 263-276 (2009).
- Shrestha, B., Vertes, A. In Situ Metabolic Profiling of Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81, 8265-8271 (2009).
- Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. Ablation and Analysis of a Single Cell by Consecutive Laser Pulses. Applied Physics A. , (2010).
