Biology

在大气压力质谱直接分析单细胞

Published: September 4, 2010 doi: 10.3791/2144

¹Department of Chemistry, George Washington University

Summary

使用锋利的光纤样品激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）质谱细胞，单细胞分析是通过质谱在大气压力下的植物和动物细胞。

Abstract

在单个细胞的生化物质的分析是理解细胞代谢，细胞周期，适应，疾病状态等的重要，即使是相同的细胞类型表现出异质性的生化妆，根据他们的生理条件和与环境的相互作用。常规质谱（MS）用于在单细胞生物分子分析的方法依赖于广泛的样品制备。卸下从他们的自然环境和丰富的来样加工细胞可能会导致细胞成分的变化。环境电离方法使在其原生环境，并没有广泛的样品制备样品的分析，中红外（中红外）激光波长为2.94微米的生物材料的烧蚀技术利用的水突然激发，结果在第一阶段爆炸²环境中红外激光辐射，如激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）和红外大气压力基质辅助激光解吸电离（AP红外MALDI），电离技术，成功地展示了能力直接分析水丰富的组织和biofluids在大气压力。LAESI，主要是中性的颗粒物质从高电荷的电液滴产生离子的样品coalesces组成的中红外^激光烧蚀羽3-11。近日，中红外单细胞消融提供通过蚀刻光纤中红外辐射。从这个消融产生的羽postionized电能够在单细胞LAESI - MS分析多样化的代谢产物。本文介绍了单细胞LAESI - MS分析的详细协议。视频演示一个单一的洋葱灯泡皮肤表皮细胞的分析。该系统的原理图如图1所示。图2提供了一个有代表性的例子是单细胞消融和细胞LAESI质谱。

Protocol

1。光学元件

激光烧蚀激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）质谱（MS）是由5 ns的激光脉冲的波长为2.94微米。一个可调谐光参量振荡器驱动的Nd：YAG激光（100 Opolette Opotek公司，卡尔斯巴德，CA）是用于在这项研究中消融。选择的重复速率是5和100赫兹之间。这是一个IV级激光直接照射后，可能会导致严重的永久性的损害眼睛或皮肤。漫反射的激光束也可以到皮肤或眼睛有害。穿戴合适的激光护目镜保护。
二氧化锗的玻璃制成的光纤红外光纤系统公司（银泉，MD）获得。如果有HYTREL和聚酰亚胺纤维上的涂料按照下列指示以消除他们从两端。热1 - 甲基-2 - 吡咯烷酮至130-150 ° C的通风柜。沾纤维结束时，你想将这种液体地带大约1分钟或直到涂层开始软化和剥离。软化涂层浸入甲醇或异丙醇一分钟，并用不起毛的免费餐巾纸擦去任何剩余的涂料。除去涂层后，切割的蓝宝石刀片（KITCO光纤，弗吉尼亚海滩，弗吉尼亚州）的得分和轻轻贴紧光纤两端。
为了实现所需的清晰度，化学蚀刻的光纤尖端的一端由1％（V / V）硝酸（试剂级）解决方案。垂直浸入纤维成溶液，初次接触后的300至500微米的深度选定结束。蚀刻约15分钟后，提示会自发地脱离酸表面。这与〜15微米的曲率半径削尖的纤维尖端成果。与去离子水冲洗，以消除任何酸残基。
山在显微纤维（MN - 151，Narishige，日本东京）的蚀刻结束，并把它邻近的细胞表面高效的能量沉积（〜20微米）。
举行的光纤裸光纤夹头（BFC300，锡斯基尤公司，资助传球，或）非蚀刻结束。光学对准，光纤夹头装在一个五轴翻译（BFT - 5，锡斯基尤公司，通行证，或资助）。耦合进光纤的重点由平凸氟化钙或到非蚀刻结束防反射涂层的ZnSe镜头（红外光学产品，明代，NY）束激光能量（0.5至1兆焦耳）。受保护的金镜（PF10 - 03 - M01，Thorlabs，牛顿，新泽西州）是用于引导到中红外激光束的聚焦镜头。

2。电安装

电系统，可使用以下几部分组成：金属导电全氟套圈，配件，油管套，针端口（如U - 435，M215，F - 331Nx F - 242X，9013，分别IDEX健康与科学的结合，构造橡树港，WA）以及熔融石英管（例如，CT360 - 100 - 50 - 5，新的目标公司，沃本，MA）。建议的发射器是由不锈钢制成，并有一个50微米的ID（例如，MT320 - 50 - 5 - 5，新的目标公司，沃本，马萨诸塞州）的锥形尖。
准备50％甲醇溶液与0.1％的乙酸（V / V）的电。解决的办法是在200至300 NL /分钟注射泵（哈佛器械，Holliston，MA）的速度泵使用，例如，一个500μL注射器（81222，汉密尔顿公司，里诺，内华达州）。
稳压电源（PS350，斯坦福研究系统公司，桑尼维尔，加利福尼亚），产生一个稳定的电2,800 3,000 V之间的高电压应用的金属工会。确保所有电气连接是安全的和正确的接地与屏蔽屏蔽。与暴露的高压直接接触可能会导致触电。

3。样品处理

从适当的来源获取活组织或细胞样本，并让他们像以前那样分析建议。此演示洋葱灯泡是从当地的商店购买。由外科手术刀纵向切球。一个规模数厘米长的段，分段成条状。一个完整的单层表皮组织的内在揭下。
湿表面的表皮是用于安装预清洗玻璃显微镜玻片上的组织。由通用板的持有人装上定位的三轴翻译阶段（FP01，Thorlabs公司，牛顿，新泽西州）举行的幻灯片。收购后立即安装，以防止细胞退化的样品的质谱。

4。可视化系统

两个长途显微镜是用来选择的细胞进行分析，并保持削尖纤维尖端与细胞表面之间的距离。后者安装在15 ° -30 °，从表面测量角度。该系统组成的人翁远程视频显微镜5倍至无限远（7X变焦精密光学，光学埃德蒙，巴林顿，新泽西州）纠正与CCD摄像头（F131马林，盟军视觉技术装备的物镜（2平方米APO 5倍，三丰公司，神奈川县，日本） Stadtroda，德国）为监测和图像采集。
第二个视频显微镜安装在样品表面成直角，从顶部的可视化细胞。本系统提供可视化反馈，超过消融和分析选定的单元格对齐纤维尖端。它包括一个7倍变焦精密光学（埃德蒙光学，巴林顿，新泽西州）装有10倍无穷大，纠正长工作距离物镜（2平方米APO 10倍，三丰公司，神奈川县，日本）和CCD相机。

5。收购质谱

打开激光，电和质谱仪，例如，一个四极杆飞行时间系统（Q - TOF总理，沃特斯，米尔福德，马）。 LAESI离子源的几何结构优化调整消融点和彼此之间的相对电发射器和质谱仪的孔口，以达到最大的离子强度的位置。
选择使用的顶视图可视化系统的细胞进行分析的兴趣。选择后，将在样品台上，带来的直接低于光纤削尖的提示选定的单元格。使用侧视镜调整尖〜20微米的细胞表面的距离。
在选定的单元格通过蚀刻纤维尖端发射激光脉冲。这一结果在细胞壁和细胞质中的颗粒物的形式弹射穿孔。 postionization后由电，产生的离子质谱仪及质谱收集记录。
数据采集后，把激光，电和在待机状态下的质谱仪，或将其关闭。保持的消融A。 CEPA为光镜可选观察组织样本。

6。代表性的成果

消融成功的一个单细胞在细胞壁和收集了LAESI质谱爆破结果。通常一个不成功的实验结果没有消融和/或没有质谱。出于演示的目的，我们目前的结果，从一个单一的嵌入式一个答：表皮细胞LAESI - MS分析CEPA灯泡。图2a显示了一个代表一个细胞的采样后的光学显微镜图像。细胞壁是穿孔和穿孔的程度是有限与邻近细胞的界限。相邻的细胞似乎是完整的。图2b显示了从细胞产生一个代表LAESI质谱。多种检测到的离子的A. CEPA细胞，并基于对他们的准确群众，同位素分布格局，并在某些情况下，串联质谱，他们试探性地分配到内源性代谢物。从单个细胞中检测到的离子类似的观察分析，在相同的组织由多个单元格的传统LAESI ^- MS的13。

图1。 LAESI - MS的单细胞分析示意图。一个中红外激光脉冲耦合到光纤和交付置于玻片上的样本。削尖的纤维尖端光聚焦到靶细胞和能量沉积阵阵细胞。生产消融羽（红点）合并电柱（黑点）的水滴凝聚样品中特定离子生产（绿色圆点）。这些离子质谱仪（MS）分析和检测。两个长距离视频显微镜，显微镜1和显微镜2，利用监测的光纤尖端与细胞表面之间的距离，并选择一个细胞，分别进行分析。

图2a
图2a。消融的标志，一个答一个单一的表皮细胞CEPA灯泡。相邻的细胞没有表现出明显的损坏，随后可单独分析。

图2b
图2b。质谱对应一个单一的A。消融CEPA表皮细胞显示，小学和次生代谢产物的存在。

Discussion

细胞的细胞质和细胞壁或膜的拉伸强度的含水量都消融在LAESI - MS分析单细胞的关键因素。激光能量密度进行调整，以达到不同的细胞类型的消融阈值。交付的激光能量密度取决于激光脉冲的能量和纤维尖端与细胞表面之间的距离。尽量减少扰动邻近的细胞，在单细胞分析是至关重要的。烧蚀阈值保持在激光能量限制在相邻细胞的分析效果。

潜在的应用之一就是使用自然容积化学成像像素（体素）由MS的单细胞。人工往往是矩形网格上收集数据相比，一个组织一个细胞化学成像时间更可能保留空间组织的细胞间的生化相互作用。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

作者承认由以下机构的财政支持;，美国国家科学基金会（格兰特0719232），能源部（批准DEFG02 - 01ER15129），WM凯克基金会（格兰特041904），和乔治华盛顿大学的研究加强基金。作者感谢慷慨红外纤维系统（银泉，MD），以及提供初步的协议，讨论关于纤维由Mark E. Reeves和“乔治华盛顿”琼A.霍夫曼蚀刻二氧化锗基于光纤大学。作者还要感谢她的帮助下在议定书摄录杰西卡A. Stolee。