Summary
Enkele cel analyse wordt uitgevoerd door middel van massaspectrometrie op plantaardige en dierlijke cellen bij atmosferische druk met behulp van een scherp glasvezelkabel aan de cellen voor laser-ablatie electrospray ionisatie (LAESI) massaspectrometrie monster.
Abstract
Analyse van de biochemische in enkele cellen is belangrijk voor het begrijpen van de celstofwisseling, celcyclus, aanpassing, ziektetoestanden, enz. Zelfs dezelfde celtypen heterogene biochemische samenstelling, afhankelijk van hun fysiologische omstandigheden en interacties met de omgeving vertonen. Conventionele methoden van massaspectrometrie (MS) die wordt gebruikt voor de analyse van biomoleculen in enkele cellen rekenen op een uitgebreide monstervoorbereiding. Het verwijderen van de cellen van hun natuurlijke omgeving en een uitgebreide steekproef verwerking zou kunnen leiden tot veranderingen in de cellulaire samenstelling. Ambient ionisatie methoden in staat stellen de analyse van monsters in hun eigen omgeving en zonder uitgebreide monstervoorbereiding. 1 De technieken gebaseerd op het midden van de infrarood (mid-IR) laser ablatie van biologische materialen bij 2,94 micrometer golflengte de plotselinge excitatie van het water gebruiken dat resulteert in fase explosie. 2 Ambient ionisatie-technieken op basis van mid-IR-laser straling, zoals laser ablatie electrospray ionisatie (LAESI) en atmosferische druk infrarood matrix-assisted laser desorptie ionisatie (AP IR-MALDI), hebben met succes aangetoond de mogelijkheid om direct te analyseren water- rijke weefsels en biovloeistoffen bij atmosferische druk. 3-11 In LAESI het midden van de IR-laser ablatie pluim die voornamelijk bestaat uit neutrale deeltjes uit het monster samensmelt met een sterk geladen elektrospray druppels om ionen te produceren. Onlangs werd mid-IR ablatie van enkele cellen die door het leveren van de mid-IR-straling door een geëtste vezel. De pluim gegenereerd uit deze ablatie werd postionized door een electrospray waardoor de analyse van de verschillende metabolieten in enkele cellen door LAESI-MS. 12 Dit artikel beschrijft het gedetailleerd protocol voor single cell analyse met behulp van LAESI-MS. De gepresenteerde video toont de analyse van een enkele epidermale cel uit de huid van een Allium cepa gloeilamp. Het schema van het systeem is weergegeven in figuur 1. Een representatief voorbeeld van enkele cel ablatie en een LAESI massaspectrum van de cel worden gegeven in figuur 2.
Protocol
1. Optische Componenten
- Laser ablatie voor laser-ablatie electrospray ionisatie (LAESI) massaspectrometrie (MS) is geproduceerd door een 5 ns laser puls op 2,94 micrometer golflengte. Een instelbare optische parametrische oscillator wordt aangedreven door een Nd: YAG laser (Opolette 100, Opotek Inc, Carlsbad, CA) wordt gebruikt voor ablatie in deze studie. De herhalingsfrequentie wordt gekozen tussen de 5 en 100 Hz. Dit is een klasse IV laser die bij directe blootstelling kan ernstige blijvende schade aan de ogen of de huid veroorzaken. De diffuse reflectie van de laserstraal kan ook gevaarlijk zijn voor de huid of ogen. Draag een geschikte laser bril voor bescherming.
- De optische vezel gemaakt van germanium kooldioxide gebaseerde glas werd verkregen van Infrared Fiber Systems, Inc (Silver Spring, MD). Als er Hytrel en polyimide coatings op de vezel onderstaande volg de aanwijzingen om ze te verwijderen uit de uiteinden. Verhit 1-methyl-2-pyrrolidinon tot 130-150 ° C in een zuurkast. Dompel de vezel uiteinden u wilt in deze vloeistof strook voor ongeveer 1 minuut of totdat de coating begint te verzachten en afschilferen. Dompel de zachte coating in methanol of isopropanol voor een minuut, en veeg de resterende coating met een niet-pluizende servet. Na het verwijderen van de coating, kleven beide uiteinden van de vezel met een saffier mes (KISMA Fiber Optics, Virginia Beach, VA) door te scoren en voorzichtig happen ze.
- Om de gewenste scherpte te bereiken, chemisch etsen het ene uiteinde van de vezel tip met 1% (v / v) salpeterzuur (reagens kwaliteit) oplossing. Verticaal dompel het geselecteerde einde van de vezel in de zure oplossing tot een diepte van 300 tot 500 pm na het eerste contact. Na ongeveer 15 minuten van etsen, zal de tip spontaan los te maken van het zuur oppervlak. Dit resulteert in een geslepen vezelpunt met ~ 15 micrometer kromtestraal. Spoelen met gedemineraliseerd water om zure resten te verwijderen.
- Monteer de geëtste einde van de vezel op een micromanipulator (MN-151, Narishige, Tokyo, Japan) en breng het aan de nabijheid (~ 20 urn) van het celoppervlak voor een efficiënte energie-depositie te sluiten.
- Houd de niet-geëtste uiteinde van de optische vezel door een kale glasvezel chuck (BFC300, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR). Voor optische uitlijning, is de vezel boorkop gemonteerd op een vijf-assige vertaler (BFT-5, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR). De laser energie (0,5 tot 1 mJ) is gekoppeld in de vezel door zich te richten de bundel door een plano-convexe calciumfluoride of antireflectie coating ZnSe lens (infrarood optische producten, Farmingdale, NY) op haar niet-geëtste end. Beschermde goud spiegels (PF10-03-M01, Thorlabs, Newton, NJ) worden gebruikt om de mid-IR laserstraal te sturen op de lens.
2. Electrospray Setup
- Het electrospray systeem kan worden gebouwd met behulp van de volgende componenten: metalen vereniging met geleidende perfluorelastomeer adereindhuls, fittingen, slangen mouw, naald-poort (bijvoorbeeld U-435, M215, F-331Nx, F-242x, 9013, respectievelijk IDEX Health & Sciences, Oak Harbor, WA) evenals kwartsglas buizen (bijv. CT360-100-50-5, nieuwe doelstelling Inc, Woburn, MA). De aanbevolen emitter is gemaakt van roestvrij staal en heeft een conische tip met een 50 um id (bv, MT320-50-5-5, nieuwe doelstelling Inc, Woburn, MA).
- Bereid 50% methanol-oplossing met 0,1% azijnzuur (v / v) voor de electrospray. De oplossing wordt gepompt met een snelheid van 200 tot 300 nl / min door een injectiepomp (Harvard Apparatuur, Holliston, MA) met behulp van, bijvoorbeeld, een 500 ul spuit (81222, Hamilton Company, Reno, NV).
- Van toepassing zijn hoge spanning tussen 2800 en 3000 V aan het metaal unie door een gestabiliseerde voeding (PS350, Stanford Research Systems Inc, Sunnyvale, CA) een gestage electrospray genereren. Zorg ervoor dat alle elektrische aansluitingen in orde zijn en afgeschermd met de afscherming geaard. Direct contact met zichtbare hoge spanning kan leiden tot een elektrische schok.
3. Monstername
- Verkrijgen van de live-weefsel of cellen monster uit een geschikte bron en bewaar ze als aanbevolen voor de analyse. De Allium cepa bollen voor deze demonstratie werden gekocht van een plaatselijke winkel. Lengterichting gesneden een gloeilamp door een chirurgische scalpel. Een paar centimeter segment van een schaal was coupes in een strip. Een intacte monolaag van de innerlijke epidermale weefsel wordt afgepeld.
- Het natte oppervlak van de epidermis wordt gebruikt om het weefsel te monteren op een pre-gereinigde glazen microscoopglaasje. Houd de dia door een algemeen doel plaat houder (FP01, Thorlabs Inc, Newton, NJ), gemonteerd op een drie-assige vertaling podium voor het positioneren. Het verwerven van de massaspectra direct na montage van de steekproef naar cel degradatie te voorkomen.
4. Visualisatie Systeem
- Twee lange afstand microscopen worden gebruikt om de cellen voor analyse te selecteren en om de afstand tussen de geslepen vezelpunt en het celoppervlak te behouden. Dit laatste is gemonteerd onder de 15 ° -30 ° hoek gemeten vanaf het oppervlak. Dit systeem bestaat uit along afstand videomicroscoop (7x zoom optische precisie, Edmund Optics, Barrington, NJ), met een 5x oneindig gecorrigeerd objectief lens (M Plan Apo 5x, Mitutoyo Co, Kanagawa, Japan) zijn uitgerust met een CCD-camera (Marlin F131, Allied Vision Technologies , Stadtroda, Duitsland) voor het monitoren en beeld vast te leggen.
- De tweede video microscoop is gemonteerd in een rechte hoek ten opzichte van het monster oppervlak om de cellen van de top te visualiseren. Dit systeem biedt visuele feedback af te stemmen op de vezel tip over de cel geselecteerd voor ablatie en analyse. Het bestaat uit een 7x optische zoom precisie (Edmund Optics, Barrington, NJ), uitgerust met een 10x infinity gecorrigeerd lange werkafstand objectief lens (M Plan Apo 10x, Mitutoyo Co, Kanagawa, Japan) en een CCD-camera.
5. Overname van Mass Spectra
- Zet de laser, de electrospray en de massa spectrometer, bijvoorbeeld, een quadrupool time-of-flight systeem (Q-TOF Premier, Waters, Milford, MA). Optimaliseren van de geometrie van de LAESI ionenbron door het aanpassen van de positie van de ablatie ter plaatse en electrospray emitter ten opzichte van elkaar en de opening van de massa spectrometer om een maximale ionenintensiteiten te bereiken.
- Selecteer de cel van belang zijn voor analyse door het gebruik van de top-view visualisatie systeem. Na selectie, zet de steekproef podium om de geselecteerde cel direct onder de verscherpte uiteinde van de optische vezel te brengen. Met behulp van de zijaanzicht microscoop passen de tip-tot-cel oppervlak van de afstand tot ~ 20 urn.
- Brand laserpulsen bij de geselecteerde cel via de geëtste vezelpunt. Dit resulteert in de perforatie van de celwand en het uitwerpen van het cytoplasma in de vorm van fijn stof. Na postionization door de elektrospray, de geproduceerde ionen worden verzameld door de massa-spectrometer en de massa spectra worden opgenomen.
- Na de data-acquisitie, zet de laser, de electrospray en de massa spectrometer in de standby-modus of ze uit te schakelen. Houd de geablateerd A. cepa weefselmonster voor optionele observatie door lichtmicroscopie.
6. Representatieve resultaten
Succesvolle ablatie van een enkele cel resulteert in het uiteenspatten van de celwand en het verzamelen van een LAESI massaspectrum. Een mislukte experiment resulteert meestal in een mum van ablatie en / of geen massa spectrum. Ter demonstratie, presenteren we de resultaten van de LAESI-MS analyse van een enkele embedded epidermale cel van een A. cepa gloeilamp. Figuur 2a toont een vertegenwoordiger van optische microscopie afbeelding na de bemonstering van een cel. De celwand is geperforeerd en de omvang van de perforatie wordt beperkt door de grenzen met de naburige cellen. De aangrenzende cellen lijken intact. Figuur 2b toont een vertegenwoordiger LAESI massaspectrum geproduceerd uit de cel. Een grote verscheidenheid van ionen worden gedetecteerd vanuit de A. cepa cel en op basis van hun juiste massa, isotoop distributie patronen, en in sommige gevallen, tandem massaspectra, ze zijn voorlopig toegewezen aan endogene metabolieten. De ionen gedetecteerd uit een enkele cel waren vergelijkbaar met die waargenomen in de analyse van hetzelfde weefsel door de conventionele LAESI-MS van meerdere cellen. 13
Figuur 1. Schematische voorstelling van single cell analyse door LAESI-MS. Een mid-IR laser puls is gekoppeld in een optische vezel en afgeleverd bij de steekproef die op glasplaatje. De geslepen vezelpunt richt het licht in de doelcel en de gedeponeerde energie barst de cel. De geproduceerde ablatie pluim (rode stippen) is samengevoegd met een electrospray pluim (zwarte puntjes) de druppels samensmelten (groene stippen), resulterend in de steekproef van specifieke ion productie. Deze ionen worden geanalyseerd en gedetecteerd door de massa-spectrometer (MS). Twee lange afstanden video microscopen, Microscoop 1 en 2 Microscope, worden gebruikt om de afstand tussen de vezel tip en het celoppervlak te volgen en een cel voor analyse, respectievelijk te selecteren.
Figuur 2a. Ablation merkteken op een epidermale cel van een A. cepa gloeilamp. De aangrenzende cellen vertonen geen zichtbare schade en vervolgens kunnen afzonderlijk worden geanalyseerd.
Figuur 2b. Mass spectrum dat overeenkomt met de ablatie van een A. cepa epidermale cel toont de aanwezigheid van primaire en secundaire metabolieten.
Discussion
Het watergehalte van de cel cytoplasma en de treksterkte van de celwand of membraan zijn kritische factoren voor de ablatie van enkele cellen tijdens LAESI-MS-analyse. De laser Fluence moet worden aangepast aan de ablatie drempels van de verschillende celtypes te bereiken. De geleverde laser Fluence is afhankelijk van de energie van de laser puls en op de afstand tussen de vezel tip en het celoppervlak. Het minimaliseren van de verstoring van de naburige cellen gedurende de enkele cel analyse is van cruciaal belang. Het houden van de laser energie op de ablatie grenswaarden van het effect van analyse van de aangrenzende cellen.
Een van de mogelijke toepassingen is het gebruik van enkele cellen als de natuurlijke volumetrische pixels (voxels) voor chemische beeldvorming door MS. In vergelijking met het verzamelen van gegevens op een kunstmatig vaak rechthoekig rooster, chemische beeldvorming van een weefsel een cel op een moment is meer kans om de ruimtelijke organisatie van biochemische interacties tussen cellen te behouden.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs erkennen financiële ondersteuning door de volgende instellingen, de National Science Foundation (Grant 0.719.232), het Department of Energy (Grant DEFG02-01ER15129), de WM Keck Foundation (Grant 041.904) en de George Washington University Research Enhancement Fund. De auteurs zijn dankbaar voor de GeO2-gebaseerde optische vezels gul geleverd door Infrared Fiber Systems (Silver Spring, MD), evenals voor de eerste bespreking van het protocol inzake het vezel-ets van Mark E. Reeves en Joan A. Hoffmann van de George Washington universiteit. De auteurs wil ook Jessica A. Stolee bedanken voor haar hulp tijdens de video-opnamen van het protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Fluka | 45727 | |
| Methanol | Fluka | 65548 | |
| 1-methyl-2-pyrrolidinon | Sigma-Aldrich | M79603 | |
| Water | Fluka | 39259 |
References
- Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Ambient Mass Spectrometry. Science. 311, 1566-1570 (2006).
- Chen, Z. Y., Vertes, A. Early plume expansion in atmospheric pressure midinfrared laser ablation of water-rich targets. Physical Review E. E77, 036316-036316 (2008).
- Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. Atmospheric Pressure Molecular Imaging by Infrared MALDI. Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 79, 523-532 (2006).
- Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. Atmospheric Pressure Infrared MALDI Imaging Mass Spectrometry for Plant Metabolomics. Analytical Chemistry. 80, 407-420 (2007).
- Nemes, P., Vertes, A. Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 79, 8098-8106 (2007).
- Shrestha, B., Li, Y., Vertes, A. Rapid analysis of pharmaceuticals and excreted xenobiotic and endogenous metabolites with atmospheric pressure infrared MALDI mass spectrometry. Metabolomics. 4, 297-311 (2008).
- Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. Ambient Molecular Imaging and Depth Profiling of Live Tissue by Infrared Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 80, 4575-4582 (2008).
- Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81, 6668-6675 (2009).
- Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82, 982-988 (2010).
- Shrestha, B. Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry. Analyst. , Forthcoming (2010).
- Sripadi, P., Nazarian, J., Hathout, Y., Hoffman, E., Vertes, A. In vitro analysis of metabolites from the untreated tissue of Torpedo californica electric organ by mid-infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Metabolomics. 5, 263-276 (2009).
- Shrestha, B., Vertes, A. In Situ Metabolic Profiling of Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81, 8265-8271 (2009).
- Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. Ablation and Analysis of a Single Cell by Consecutive Laser Pulses. Applied Physics A. , (2010).
