Summary
Этот протокол описывает изоляции и распада тканей медуллобластомой мыши и последующем аллотрансплантации опухолевых клеток в иммунитетом мышей трансплантации, с тем чтобы начать вторичные медуллобластомой.
Abstract
Медуллобластомой является наиболее распространенным педиатрической опухоли нервной системы. Большой объем исследований на животных было сосредоточено на мозжечковой гранул нейрона прекурсоров (CGNPs) в качестве клеточной из-за происхождения медуллобластомой 1-4. Тем не менее, разнообразные клинические проявления медуллобластомой подтипов в человеческом пациентов (узловой, вызывающий развитие фиброзной ткани, классические и большую клетку / анапластическая), а также тот факт, что медуллобластомой находится в подмножество человека пациентов без внематочной выражение CGNP маркер 5, показывают, что клеточном и молекулярном происхождении медуллобластомой являются более сложными и далеко не полностью расшифрован. Поэтому важно определить, есть ли альтернативные опухоли медуллобластомой клеточной от происхождения на основании которых камерного типа конкретной терапевтической модальности могут быть разработаны. С этой целью, внутричерепная ортотопической аллотрансплантации генетически отмеченные типы клеток опухоли с последующим анализом вторичного развития опухоли у реципиентов позволит определения сотовой происхождении опухоли, инициирующие клетки. Здесь мы опишем экспериментальный протокол для внутричерепного ортотопической аллотрансплантации медуллобластомы клетки, полученные из первичной опухоли ткани, и эта процедура может также использоваться для пересадки клетки от установленных клеточных линий.
Protocol
1. Микро-рассечение опухоль мозжечка и диссоциация опухолевой ткани
- Восстановление опухолевой ткани
- Больных мышей с медуллобластомой часто runted и отображения гидроцефалия и типичных неврологических симптомов, включая паралич задних и неудачи, чтобы восстановить положение, когда отменяют. Чтобы получить опухолевой ткани, усыпить мышей углерода вдыхания газа. Это Тон задает не выполнять шейки дислокации, процедура, которая создает давление на задний черепа и может поставить под угрозу целостность ткани опухоли.
- Обезглавливание выполняется сразу же после смерти с помощью пары ножниц, удаление волос и мышечную ткань как можно больше для хорошей визуализации черепа. Очистите поверхность черепа с Kimwipe пропитанный 95% этанола.
- Использование тонких ножницы, чтобы вырезать отверстие вдоль средней линии черепа, черепа и удаления ткани с помощью тонкой пинцетом, после чего весь мозг, включая опухоль мозжечка подвергается.
- Хотя cerebella здоровых взрослых дисплей четко определенных полушарий и червя, cerebella с опухолями мышей часто увеличены, аморфное с гладкой поверхностью и заметным кровеносных сосудов. Использование стерильных техник, получить опухоль мозжечка с помощью пинцета, поместить в ледяной фосфатным буферным раствором (PBS) без Mg 2 + и Ca 2 +.
Примечание: все инструменты дезинфицируют в 95% этанола и паровой автоклав перед использованием.
- Диссоциация опухолевой ткани
- Передача опухолевую ткань от PBS до 50% Accutase (разводят в PBS), примерно в 4 раза объема опухолевой ткани, пропустить через мясорубку с мелкой ткани ножницами в течение 3 минут при комнатной температуре, после инкубации при температуре 37 ° С в течение 4 минут , после чего ткань подвергается повторяющимся pipeting с 1-мл Pipetman за дополнительные 3 минуты. Этот метод должен дать смесь отдельных клеток и небольших сотовых агрегатов.
- Развести суспензии клеток в 3 раза с PBS и центрифуги в течение 5 минут при 1000xg для осаждения клеток. (Выше процедуры были описаны в «Изоляция, обогащения и поддержания стволовых клетках медуллобластомой", Юпитер в печати)
Ресуспендируют осадок клеток в свежеприготовленный нейронных стволовых клеток среда, состоящая из Neurobasal среде с глютамином, пенициллин-стрептомицина, N2, B27, человеческого эпидермального фактора роста (25 нг / мл) и основной FGF (25 нг / мл). Вычислить плотность клеток решение и сделать соответствующие дальнейшие разведения с дополнительными нейронных стволовых клеток среду так, что одно может загрузить 4 мкл раствора с соответствующим количеством диссоциированных опухолевых клеток, например, 5x10 5, в стерильный конических наконечником 10 мкл шприц. Точное число ячеек, которые будут прививки должны быть определены исследователем в соответствии с конкретными экспериментальными требованиям. Хранить раствор в ячейку 200 мкл мини трубка микроцентрифужных (ПЦР трубкой) на льду.
2. Анестетики Процедуры Получатель Мыши
Для хирургической процедуры, дезинфекция области, посвященной грызунов необходима операция на время процедуры. В идеале, создать длинную скамью с отдельными, но и прилегающие области животного подготовки, операционное поле и животных восстановления. Хирургические перчатки, перчатки не экзамен, необходимые для операции. Асептики ведется путем проведения перчатках выше талии и использоваться только для обработки стерильным объектов из сухой стерильной поверхности.
- Смеси кетамина (100 мг кетамина на 1 кг веса мыши) и ксилазина (10 мг ксилазина на 1 кг веса мыши) используется для анестезии. Администрирование анестетиков внутрибрюшинно.
- Как правило, занимает 3-5 минут для анестезии для полного эффекта. Определить, является ли мышь полностью под наркозом на ноги / хвост крайнем случае. Нанесите небольшое количество глазной мази на глазах мыши. Принесите полностью наркозом мыши в операционной области, постоянный мониторинг, чтобы убедиться, что мышь дышит нормально.
3. Внутричерепное Прививка опухолевых клеток
- Бритье спинной задней области глава мыши, используя машинки для стрижки волос, выявить задней череп выше среднего мозга и мозжечка.
- Применить Бетадин раствор на кожу головы подвергается использованием аппликатора хлопка наконечником, после чего протрите спиртом площадку. Повторите эти два шага стерилизации в два раза.
- Сделать четверть дюйма разрез в коже головы задних использованием стерилизованных скальпеля. Дрель 0,5 мм заусенцев отверстие 2 мм вправо и на 2 мм сзади лямбда использованием стерильных бормашины.
- Наведите на стереотаксическая рама, зацепив его резцов на раме, выполнены. Осторожно спускаемся и позиции конических наконечником 10 мкл шприц загружается с 4 мкл опухолевых клеток в решении заусенцев дыры. Как только срез syriНге игла находится ниже поверхности черепа, спуск еще на 3 мм, а затем подняться на 0,5 мм. Медленно вводить нужное количество опухолевых клеток, с устойчивой силой в 30-секундный промежуток времени, в мозжечке получателя. Оставьте иглу на его месте после окончания инъекций в течение дополнительных двух минут. Затем удалить иглу и шприц. Клип раны использованием autoclip.
- Держите мышь на потепление одеяло после операции, чтобы помочь сохранить свою температуру тела. Мобильность и дыхательных моделей будет наблюдаться постоянно. Как только мышь оправится от анестезии, поместить его обратно в стерильные клетки жилья. Монитор в день на питание и забора воды, поведение, уход, и красная окраска глаз. Проверьте, нет ли признаков инфекции в разрез сайта. Удалить autoclips на 7 день после операции.
Поддерживать мышей в среднем на 2-6 месяцев и самопожертвования тех, отображающий типичные симптомы медуллобластомой для дальнейших исследований.
4. Представитель Результаты
Вторичные Медуллобластомы разработаны в получающих мышей очень походили на те из первичных опухолей. Cerebella подшипников вторичные опухоли часто были увеличены, аморфное с внематочной кровеносных сосудов очевидным, если смотреть в целом-крепления. Иммуногистохимический анализ вторичной опухолевой ткани, показало, что опухолевые клетки высоко пролиферативные, выражать сильные SmoM2-YFP и маркеры нейронов мозжечка гранул прекурсоров, таких как Math1 и Pax6. Когда диссоциированных и культурной использованием сообщили методы («Изоляция, обогащения и поддержания стволовых клетках медуллобластомой", Юпитер в печати), вторичные опухолевые клетки медуллобластомой может быть быстро увеличена, выражают несколько маркеров стволовых клеток, которые клоногенных и может инициировать дальнейшее формирование опухоли, когда пересаживают в дополнительных иммунитетом получателей.
Рисунок 1. Типичные целом монтажа и секционных виды вторичных тканей медуллобластомой
Типичный пример вторичных тканей медуллобластомой разработаны 26 дней после введения 5x10 5 первичных опухолевых клеток. Гематоксилин окрашивание выявляет типичные клеточной морфологии медуллобластомы, в том числе высоких ядерных / цитоплазматическим отношением и ядерным полиморфизмом. Эти вторичные опухолевые клетки высоко пролиферативные как указано Ki67 выражения, и они также энергично выражать мембранных SmoM2-YFP.
Рисунок 2. Аккумуляторы медуллобластомой может быть культурным и расширена в пробирке
Использование протокола описаны для первичного мыши медуллобластомой клетки ("Выделение, обогащения и поддержания стволовых клетках медуллобластомой", Юпитер в печати), эти вторичные клетки медуллобластомой может быть культурным и расширена для многократного прохода. На снимке же колонии опухоли представитель культивировали при 4 дня и 14 дней. Культивированных клеток опухоли биполярной, удлиненные со скудной цитоплазмой и часто исходят от плотного ядра клеточного агрегата. Они не проявляют торможение роста контакта. Небольшие круглые клетки красных кровяных телец.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несколько важных факторов для успешного ячейки медуллобластомой аллотрансплантации, что дает вторичное образование опухоли в следующем: Во-первых, использовать только 50% Accutase для ткани диссоциации и не по-дайджест ткани, как длительное лечение фермента приводит к значительному снижению жизнеспособности клеток. Также используйте только 1 мл размера Pipetman также небольшие советы могут также генерировать физические повреждения диссоциированных клеток. Это прекрасно, чтобы смесь отдельных клеток и малых агрегатов для аллотрансплантации. Во-вторых, перемешать и равновесие опухоли решение ячейки каждый раз перед загрузкой шприце Hamilton. Не используйте более 4 мкл в каждом отдельном случае, как больший объем будет генерировать слишком много внутричерепного давления и сопротивления. Последнее очень важно, чтобы ждать еще 2 минуты, чтобы рассеяться введенного раствора в мозжечковой ткани после каждой инъекции.
Процедуры, описанные здесь, позволяет для определения генетически отмечены ячейки типа (типов), которые могут инициировать и распространять опухолей. Этот протокол применяется также к ситуациям, когда клетки, который будет введен не выводится непосредственно из первичной опухоли тканей, но и от сложившихся культурных клеточных линий. Можно приготовить соответствующее количество клеток либо пищеварения фермента и / или повторяющихся пипетки, и начните с шага 2 настоящего протокола. Таким образом, мы можем также проверить функции генов-кандидатов и тормозящее влияние химических соединений с опухолью в естественных условиях роста считывания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами Вандербильт-Инграм онкологический центр поддержки Грант (P30 CA068485), опухоли мозга у детей и Фонд Национальных институтов здравоохранения (NS042205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | 51730 | |
| Foredom flexible shaft drill, hang-up style | Stoelting Co. | 58650 | |
| Large probe holder | Stoelting Co. | 51633 | |
| 10 μL syringe, 26 ga., bevel tip | Stoelting Co. | 51105 | |
| Drill bit .75mm | Stoelting Co. | 51455-3 |
References
- Schuller, U. Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma. Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).
- Yang, Z. J. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Kessler, J. D. N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma. Genes Dev. 23, 157-170 (2009).
- Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
- Salsano, E. Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1. Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).
