Summary
هذا البروتوكول وصف العزلة وتفكك النسيج نخاعي الماوس ، واللاحقة allografting من الخلايا السرطانية في الفئران المناعة المستفيدة من أجل الشروع في نخاعي الثانوية.
Abstract
هو ورم نخاعي الأكثر شيوعا عند الأطفال في الجهاز العصبي. وركزت مجموعة كبيرة من الدراسات على الحيوانات على الخلايا العصبية للدماغ السلائف الحبيبية (CGNPs) ك خلية المنشأ من أجل نخاعي 1-4. ومع ذلك ، فإن العروض المتنوعة السريرية للمرضى في نخاعي فرعية الإنسان (عقيدية ، صلدة ، الكلاسيكية والكبيرة خلية / كشمي) ، وحقيقة أن وجدت في نخاعي مجموعة فرعية من المرضى من البشر مع عدم وجود حمل خارج الرحم من التعبير علامة CGNP 5 ، تشير إلى أن أصول الخلوية والجزيئية لنخاعي هي أكثر تعقيدا وأبعد من أن يفهمها تماما. وبالتالي ، فمن الضروري تحديد ما إذا كان هناك ورم نخاعي بديلة خلية المنشأ على أساس من نوع الخلية التي يمكن تطويرها علاجيا محددة. تحقيقا لهذه الغاية ، سوف مثلي داخل القحف allografting ملحوظ من أنواع الخلايا السرطانية وراثيا تليها تحليلات لاحقة من تطور الورم الثانوي في متلقي تسمح بتحديد منشأ الخلوي للخلايا السرطانية البدء. نحن هنا وصف بروتوكول تجريبي لمثلي داخل القحف allografting من الخلايا المشتقة من نخاعي الأنسجة الورم الرئيسي ، ويمكن أيضا أن تستخدم هذا الإجراء لزرع خلايا من خطوط الخلايا المحددة.
Protocol
1. الجزئي تشريح الورم الحاملة المخيخ وتفكك نسيج الورم
- استرجاعها من الأنسجة الورم
- وغالبا ما runted الفئران المريضة التي تحمل نخاعي ، وعرض موه الرأس وأعراض عصبية نموذجية ، بما في ذلك الشلل الخلفي والفشل في استعادة الموقف عندما انقلبت. لاسترداد أنسجة الورم ، والموت ببطء الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون. فمن imporant عدم تنفيذ خلع عنق الرحم ، وهو الإجراء الذي يولد الضغط في الجمجمة الخلفي ، ويمكن حل وسط الورم سلامة الأنسجة.
- يتم تنفيذ قطع الرؤوس على الفور بعد وفاة باستخدام مقص ، وإزالة الشعر والأنسجة العضلية قدر الإمكان عن التصور الجيد للجمجمة. تنظيف السطح من الجمجمة مع Kimwipe غارقة مع الايثانول 95 ٪.
- استخدام مقص لقطع غرامة فتح على طول خط الوسط من الجمجمة ، وإزالة الأنسجة الجمجمة باستخدام الملقط غرامة ، والنقطة التي يتعرض لها الدماغ كله بما في ذلك الورم الحاملة المخيخ.
- في حين أن مخيخات من البالغين الأصحاء عرض محددة جيدا نصفي الكرة الأرضية ودودة ، ومخيخات من الفئران الحاملة للورم وغالبا ما تكون موسعة ، غير متبلور مع سطح أملس والأوعية الدموية واضح. باستخدام تقنيات عقيمة ، استرداد ورم مخيخي باستخدام الملقط ومكان في الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بدون المغنيسيوم والكالسيوم 2 + 2 +.
ملاحظة : يتم تطهير جميع الصكوك في الإيثانول 95 ٪ وتعقيمها بالبخار قبل الاستخدام.
- تفكك نسيج الورم
- نقل أنسجة الورم من برنامج تلفزيوني لAccutase 50 ٪ (المخفف في PBS) التي هي على وشك حجم 4 مرات من نسيج الورم ، واللحم المفروم مع النسيج المقص الغرامة لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تليها الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ، وبعد ذلك يخضع الأنسجة pipeting المتكررة مع Pipetman 1 مل ل3 دقائق إضافية. هذا الأسلوب يجب أن يسفر عن خليط من الخلايا واحد ومجاميع صغيرة الخلوية.
- تمييع تعليق الخلوية 3 أضعاف مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000xg لخلايا بيليه. (وقد وصفت الإجراءات المذكورة أعلاه في "تخصيب اليورانيوم ، والعزلة وصيانة الخلايا الجذعية نخاعي" ، إن الرب في الصحافة)
Resuspend الكرية في الخلية العصبية الجذعية الطازجة المتوسطة التي تتكون من خلية متوسطة Neurobasal مع الجلوتامين ، البنسلين الستربتوميسين ، N2 ، B27 ، EGF الإنسان (25 نانوغرام / مل) ، وجمعية جيل المستقبل الأساسية (25 نانوغرام / مل). حساب كثافة خلية من الحل وجعل مزيد من التخفيفات المناسبة مع الجذعية العصبية إضافية المتوسطة الخلية بحيث يمكن للمرء أن تحميل 4 ميكرولتر من حل مع عدد مناسب من الخلايا السرطانية فصلها ، على سبيل المثال 5x10 5 ، في حقنة شطبة ذات الرؤوس 10μL العقيمة. وينبغي تحديد العدد الدقيق للتلقيح الخلايا المراد من قبل الباحث وفقا لمتطلبات معينة التجريبية. يبقي الحل الخلية في أنبوب microcentrifuge 200μL مصغرة (PCR أنبوب) على الجليد.
2. إجراءات لتخدير الفئران مستلم
لإجراء العملية الجراحية ، وهناك حاجة لتطهير منطقة مخصصة لجراحة القوارض لمدة الإجراء. من الناحية المثالية ، التي أنشئت مقعد طويل مع المناطق المجاورة ولكن منفصلة لإعداد الحيوان ، مجال التشغيل والاسترداد الحيوانية. مطلوبة القفازات الجراحية ، والقفازات الامتحان لا ، لعملية جراحية. يتم الاحتفاظ تقنية العقيم التي تشابكت أيديهما القفاز فوق الخصر وتستخدم فقط للتعامل مع الكائنات العقيمة من سطح معقمة جافة.
- ويتم استخدام مزيج من الكيتامين (100 ملغ في الكيتامين 1 كيلوغرام من وزن الفأر) وزيلازين (10 ملغ لكل 1 زيلازين كيلوغرام من وزن الفأر) لتخدير. إدارة intraperitoneally التخدير.
- يستغرق عادة 3-5 دقائق لاتخاذ تأثير التخدير الكامل. تحديد ما إذا كان الفأر هو تخدير كامل من أخمص القدمين / ذيل قرصة. ضع كمية صغيرة من مرهم عيني على العيون من الفأرة. جعل الماوس تخدير كامل لمنطقة التشغيل ، ورصد مستمر للتأكد من أن الماوس يتنفس بشكل طبيعي.
3. التطعيم داخل القحف من الخلايا السرطانية
- حلق الرأس المنطقة الظهرية الخلفي من الماوس ، وذلك باستخدام المقص الشعر ، لتكشف الجمجمة الخلفي فوق المخ الأوسط والمخيخ.
- تطبيق الحل على فروة الرأس Betadine يتعرض باستخدام قضيب غيض من القطن ، تليها المسح مع منصة الكحول. كرر هذه الخطوات اثنين تعقيم مرتين.
- جعل شق ربع بوصة في فروة الرأس الخلفية باستخدام مشرط معقم. حفر حفرة 0.5 ملم 2 ملم لدغ إلى اليمين و 2 مم الخلفي لامدا استخدام حفر الأسنان معقمة.
- ضع الماوس على إطار المجسم بواسطة تركيب القواطع والخمسين على قبضة الإطار. تنحدر بعناية وموقف شطبة 10 المحاقن ذات الرؤوس ميكرولتر محملة 4 ميكرولتر من محلول الخلية السرطانية في الحفرة لدغ. مرة واحدة في شطبة من السورىنجى الإبرة تحت سطح الجمجمة وينزل لمدة 3 ملم ثم يصعد ل0.5 مم. حقن ببطء المبلغ المطلوب من الخلايا السرطانية ، مع قوة ثابتة في إطار زمني 30 ثانية ، في المخيخ للمتلقي. ترك الإبرة في مكانها بعد الانتهاء من الحقن لدقيقتين إضافية. ثم إزالة الإبر والمحاقن. مقطع الجرح باستخدام autoclip.
- الحفاظ على الماوس على بطانية الاحترار بعد الجراحة للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة الجسم. وسيتبع أنماط التنقل والجهاز التنفسي بشكل مستمر. مرة واحدة على الماوس يتعافى من التخدير ، وضعه مرة أخرى في قفص السكن العقيمة. رصد يومي للأغذية واستهلاك المياه ، والسلوك ، والاستمالة ، وتلطيخ أحمر العينين. تفتيش بحثا عن علامات على العدوى في موقع شق. إزالة autoclips حول جراحة يوم آخر 7.
الحفاظ على الفئران لمدة متوسطها 2-6 أشهر ، وتضحية أولئك الذين تظهر عليهم اعراض نخاعي نموذجية لإجراء المزيد من الدراسات.
4. ممثل النتائج
medulloblastomas الثانوية في الفئران المتقدمة للغاية تشبه تلك المستفيدة من الأورام الابتدائية. كانت تحمل مخيخات أورام ثانوية في كثير من الأحيان الموسع ، غير متبلور مع الأوعية الدموية خارج الرحم واضحة عندما ينظر اليها ككل ، يتصاعد. وكشفت التحاليل المناعى من نسيج الورم الثانوي أن الخلايا السرطانية والتكاثري للغاية ، أعرب قوية SmoM2 - YFP وعلامات من الخلايا العصبية للدماغ السلائف الحبيبية ، مثل Math1 وPax6. عندما ينفصل وباستخدام طرق تربيتها وذكرت ("العزل ، والإثراء وصيانة الخلايا الجذعية نخاعي" ، إن الرب في الصحافة) ، ويمكن توسيع ورم نخاعي الثانوية الخلايا بسرعة ، وأعرب عن الخلايا الجذعية متعددة علامات ، هي مولد الرمع ويمكن الشروع في تشكيل المزيد من ورم عند زرع إضافية إلى المتلقين المناعة.
الشكل 1. نموذجي كامل تحميل وجهات النظر لقطاعات النسيج نخاعي الثانوية
وضع مثالا نموذجيا للنسيج نخاعي الثانوية بعد 26 يوما من حقن خلايا 5x10 5 الورم الرئيسي. تلوين الهيماتوكسيلين يكشف التشكل الخلوي للنخاعي نموذجية ، بما في ذلك نسبة النووية / هيولي العالية وتعدد الأشكال النووية. هذه الخلايا السرطانية الثانوية التكاثري للغاية كما هو مبين من قبل Ki67 التعبير وأنها أيضا تعبير بقوة الغشائي SmoM2 - YFP.
الشكل 2. يمكن تربيتها خلايا نخاعي الثانوي وتوسعت في المختبر
باستخدام بروتوكول وصف الأولية للخلايا نخاعي الماوس ("العزل ، والإثراء وصيانة الخلايا الجذعية نخاعي" ، إن الرب في الصحافة) ، ويمكن أن تكون هذه الخلايا المستزرعة نخاعي الثانوية وتوسيع نطاقها لمقاطع متعددة. صورة يظهر ورم الممثل نفسه مستعمرة مثقف في 4 أيام و 14 يوما. الخلايا السرطانية مثقف وبين القطبين ، ممدود مع السيتوبلازم شحيحة وتشع في كثير من الأحيان من نواة كثيفة من إجمالي الخلوية. انهم لا يحمل إعاقة النمو للإتصال به. خلايا صغيرة مستديرة هي خلايا الدم الحمراء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عدة عوامل حاسمة لضمان نجاح خلية نخاعي allografting أن ينتج تشكيل الورم الثانوية هي على النحو التالي : أولا ، استخدم 50 ٪ فقط Accutase لتفارق الأنسجة وليس الإفراط في هضم الأنسجة والعلاج لفترات طويلة انزيم يؤدي إلى انخفاض كبير في بقاء الخلية. أيضا استخدام فقط Pipetman حجم 1 مل وأصغر نصائح يمكن أن تولد أيضا الأضرار المادية للفصل الخلايا. لا بأس أن يكون خليطا من الخلايا واحد ومجاميع صغيرة لallografting. الثانية ، ومزيج يوازن الحل خلية الورم في كل مرة قبل تحميل حقنة هاملتون. لا تستخدم أكثر من 4 لكل ميكرولتر الحقن باعتبارها أكبر حجم من شأنه أن يولد الضغط داخل القحف بكثير جدا والمقاومة. الماضي ، من المهم الانتظار لدقائق إضافية 2 السماح للحقن محلول تتبدد في النسيج الدماغي بعد كل حقنة.
ووصف الإجراءات هنا تسمح لتحديد نوع الخلية ملحوظ وراثيا (ق) التي يمكن أن تستحدث ونشر الأورام. هذا البروتوكول ينطبق أيضا على الحالات التي لم يتم اشتقاق الخلايا ليتم حقنه مباشرة من نسيج الورم الرئيسي ، ولكن من إنشاء خطوط الخلايا المستزرعة يمكن للمرء أن يعد العدد المناسب من الخلايا بواسطة انزيم الهضم وإما / أو pipetting المتكررة ، ونبدأ من الخطوة 2 من هذا البروتوكول. لذا ، يمكننا أيضا اختبار وظائف الجينات مرشح وتأثير مثبط من المركبات الكيميائية مع قراءات في الورم للنمو الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من فاندربيلت ، انجرام السرطان غرانت مركز الدعم (P30 CA068485) ، واستئصال ورم من الدماغ مؤسسة الطفولة والمعاهد الوطنية للصحة (NS042205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | 51730 | |
| Foredom flexible shaft drill, hang-up style | Stoelting Co. | 58650 | |
| Large probe holder | Stoelting Co. | 51633 | |
| 10 μL syringe, 26 ga., bevel tip | Stoelting Co. | 51105 | |
| Drill bit .75mm | Stoelting Co. | 51455-3 |
References
- Schuller, U. Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma. Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).
- Yang, Z. J. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Kessler, J. D. N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma. Genes Dev. 23, 157-170 (2009).
- Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
- Salsano, E. Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1. Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).
