Summary
Bu protokol, fare medulloblastom doku izolasyon ve ayrılma açıklar ve ikincil medulloblastom başlatmak için immün sistemi baskılanmış alıcı farelere tümör hücrelerinin sonraki allografting.
Abstract
Medulloblastom, sinir sistemi, en sık görülen pediatrik tümördür. Hayvan çalışmalarında büyük bir vücut medulloblastom 1-4 hücre kökenli olarak serebellar granül nöron öncüleri (CGNPs) odaklanmıştır. Ancak, insan hasta (nodüler desmoplastik, klasik ve hücre / anaplastik büyük) ve medulloblastom ektopik CGNP işaretleyici 5 herhangi bir ifade ile insan hastaların bir alt kümesi bulundu olduğu gerçeğini, medulloblastom alt tiplerinin farklı klinik sunumlar öneririz. medulloblastom hücresel ve moleküler kökenleri, çok daha karmaşık ve tamamen deşifre. Bu nedenle, hücre tipi özel bir tedavi yöntemi geliştirdi dayalı alternatif medulloblastom tümör hücre-kökenli olup olmadığını belirlemek için esastır. Bu amaçla, alıcıların ikincil tümör gelişiminin sonraki analizlerde takip genetik olarak işaretlenmiş tümör hücre tiplerinin allografting intrakranial tümör başlatan hücreleri hücresel kökenli ortotopik belirlenmesini sağlayacaktır. Burada intrakranial ortotopik medulloblastom primer tümör dokusundan elde edilen hücreler, allografting için deney protokolünde tanımlamak ve bu prosedür de kurulan hücre hatları hücrelerin nakli için kullanılabilir.
Protocol
1. Tümör taşıyan Serebellum ve Tümör Doku ayrılma Micro-diseksiyonu
- Tümör dokusu alımı
- Medulloblastom taşıyan Hasta fareler genellikle runted ve hidrosefali ve posterior felç ve devrik zaman duruş yeniden yetmezliği de dahil olmak üzere tipik bir nörolojik semptomlar gösterilecek. Tümör dokusu almak için, karbon dioksit Solunduğunda fareler euthanize. Servikal dislokasyon, posterior kafatasına basınç oluşturur ve tümör dokusu bütünlüğünü tehlikeye düşürebilecek bir prosedür gerçekleştirmek için imporant.
- Decapitation kafatası iyi bir görünüm için saç ve kas dokusu mümkün olduğunca ortadan kaldırarak, bir makas kullanarak ölümünden sonra hemen yapılır. Kafatası yüzeyi,% 95 etanol ile ıslatılmış Kimwipe ile temizleyin.
- Ince makas, kafatasının orta hat boyunca bir açılış kesmek ve kafatası doku tümör taşıyan serebellum da dahil olmak üzere tüm beyin maruz kalmaktadır, bu noktada ince cımbız kullanarak kaldırmak için kullanın.
- Sağlıklı yetişkinlerin cerebella iyi tanımlanmış hemisferlerin ve vermis görüntüler, Tümör taşıyan farelere cerebella genellikle düz bir yüzey ve göze çarpan kan damarları ile amorf, büyümüş. Steril teknikleri kullanarak, buz fosfat cımbız ve yer kullanarak serebellar tümör almak Mg 2 olmadan tamponlu salin (PBS) + ve Ca 2 +.
Not: tüm araçları kullanmadan önce otoklava% 95 etanol ve buhar dezenfekte edilmektedir.
- Tümör dokusu Fototerapisi
- 4 dakika boyunca oda sıcaklığında 3 dakika 37 inkübasyon tarafından ince makas, ° C ile doku kıyma, PBS den 4 kez tümör dokusu hacmi yaklaşık% 50 Accutase (PBS içinde seyreltilmesi) tümör dokusu transferi sonra doku ilave bir 3 dakika için 1 ml Pipetman tekrarlayan pipeting uğrar. Bu yöntem, tek hücre ve küçük hücresel agrega karışımı boyun eğmek zorundadır.
- Hücresel süspansiyon PBS ve 1000xg pelet hücreleri için 5 dakika süreyle santrifüj ile 3 kat sulandırınız. (Yukarıdaki prosedürler vallahi basın, "medulloblastom kök hücrelerin izolasyonu, zenginleştirme ve bakım" olarak tarif edilmiştir)
Glutamin, Penisilin-Streptomisin, N2, B27, insan EGF (25 ng / ml) ve temel FGF (25 ng / ml) ile Neurobasal orta oluşan taze hazırlanmış sinir kök hücre orta hücre pelletini tekrar. Çözümün hücre yoğunluğu hesaplayın ve uygun daha fazla dilüsyonları bir ayrışmış tümör hücrelerinin uygun bir numarası, örneğin 5x10 5, steril bir konik uçlu 10μL şırınga içine 4 mcL çözüm yük ki bu tür ek sinir kök hücre orta yapmak . Inoküle hücreleri tam sayısı spesifik deneysel gereksinimlerine uygun olarak araştırmacı tarafından belirlenmelidir. Bir mini 200μL mikrosantrifüj tüp hücre çözümü (PCR tüp) buz üzerinde tutun.
2. Alıcı Fare Anestezik Prosedürleri
Cerrahi işlem için, kemirgen cerrahi adanmış bir dezenfekte alan prosedürün süresi için gereklidir. İdeal olarak, hayvan hazırlanması, faaliyet alanı ve hayvan kurtarma için ayrı fakat bitişik alanları ile uzun bir tezgah kurdu. Cerrahi eldivenler, muayene eldivenleri, ameliyat için gerekli. Aseptik teknik, bel üzerinde eldivenli ellerini tutarak muhafaza ve sadece kuru steril bir yüzey steril nesneleri işlemek için kullanılır.
- Ketamin (fare ağırlığı 1 kg başına 100 mg ketamin) ve xylazine (fare ağırlığı 1 kg başına 10 mg ksilizin) oluşan bir karışım anestezi için kullanılır. Anestezikler intraperitoneal Yönetici.
- Genellikle tam etkili olabilmesi için anestezikler için 3-5 dakika sürer. Bir farenin ayak / kuyruk tutam tam anestezi olup olmadığını belirleyin. Oftalmik merhem fare gözleri küçük bir miktar koyun. Sürekli fare normal nefes olduğundan emin olmak için izleme, işletim alanı için tam anestezi fare getirin.
3. Tümör Hücrelerinin Aşılama İntrakranial
- , Orta beyin ve beyincik yukarıdaki posterior kafatası ortaya çıkarmak için bir saç kesme makinesi kullanarak fare dorsal arka baş bölgesinde, tıraş.
- Alkol ped ile silerek bir pamuk uçlu aplikatör kullanarak maruz kalan kafa derisi Betadine çözümü uygulayın. Bu iki sterilizasyon adımları iki kez tekrarlayın.
- Steril bir neşter kullanılarak posterior kafa derisi çeyrek inç kesi olun. Matkap sağ 0,5 mm burr hole 2 mm ve 2 mm steril bir diş matkap kullanarak lambda posterior.
- Fare çerçevesinde tutun üzerine kesiciler çengel stereotaktik çerçeve üzerine yerleştirin. Dikkatle ineceği ve çapak deliğe tümör hücre çözümü 4 mcL yüklü konik uçlu 10 mcL şırınga pozisyon. Syri kez eğimnge iğne kafatası yüzeyi altında, başka bir 3 mm alçalma ve daha sonra 0.5 mm yükselmek. Yavaşça alıcının beyincik, 30 saniyelik bir zaman dilimi içinde sabit bir güçle, tümör hücrelerinin istenilen miktarda enjekte. Onun yerine iğne, enjeksiyon tamamlanmasından sonra ek bir iki dakika bırakın. Daha sonra iğne ve şırınga çıkarın. AutoCLIP kullanarak yara Klip.
- Kendi vücut ısısını korumaya yardımcı olmak için, ameliyat sonrası bir ısınma battaniye üzerinde fare tutun. Hareketlilik ve solunum desenler sürekli izlenecektir. Fare anestezi kurtarır sonra, steril bir konut kafesine geri koyun. Gıda ve su alımı, davranış, tımar ve gözleri kırmızı boyanması için günlük izleyin. Kesi yerinde enfeksiyon belirtileri için kontrol edin. Gün 7 cerrahi sonrası autoclips çıkarın.
2-6 ay ortalama fareler korumak ve ileri çalışmalar için tipik medulloblastom belirtileri gösteren bu fedakarlık.
4. Temsilcisi Sonuçlar
İkincil medülloblastomlar alıcı farelerde geliştirilen yüksek birincil tümörlerin benziyordu. Cerebella ikincil tümörleri taşıyan tüm bağlar olarak bakıldığında genellikle belirgin ektopik kan damarları ile amorf, büyümüş. Ikincil tümör dokusu immünohistokimyasal analizleri, tümör hücrelerinin, açık, güçlü SmoM2 YFP ve Math1 ve Pax6 gibi serebellar granül nöron öncüleri, belirteçleri yüksek proliferatif olduğunu ortaya çıkardı. Ayrışmış ve kültür rapor yöntemleri kullanarak ("İzolasyon, zenginleştirme ve medulloblastom kök hücreleri bakım" tuşuna basın Jüpiter), ikincil medulloblastom tümör hücreleri hızla genişledi olabilir zaman, açık birden fazla kök hücre belirteçleri, clonogenic ve daha fazla tümör oluşumunu başlatabilir ek immün sistemi baskılanmış alıcıları naklediliyor.
Şekil 1. Tipik tüm montaj ve ikincil medulloblastom doku kesit
5x10 5 primer tümör hücrelerinin enjeksiyonundan 26 gün sonra gelişen ikincil medulloblastom dokusu tipik bir örneği. Hematoksilen boyama yüksek sitoplazmik / nükleer oranı ve nükleer polimorfizm de dahil olmak üzere, tipik hücresel morfoloji medulloblastom ortaya koymaktadır. Ki67 ifade belirtildiği gibi bu ikincil tümör hücrelerinin yüksek proliferatif ve aynı zamanda güçlü bir membranöz SmoM2-YFP ifade.
Şekil 2. İkincil medulloblastom hücrelerin in vitro kültürü ve genişletilebilir
Birincil fare medulloblastom hücreleri ("İzolasyon, zenginleştirme ve medulloblastom kök hücreleri bakım" tuşuna basın Jüpiter) açıklanan protokol kullanarak, bu ikincil medulloblastom hücrelerinin kültürlü ve birden fazla geçit için genişletilmiş. Resim, 4 gün ve 14 gün kültüre aynı temsilcisi tümör koloni gösterir. Kültür tümör hücrelerini bipolar, uzun hücresel agrega yoğun bir çekirdek genellikle yetersizdir sitoplazma ve yayar. Bu büyüme temas inhibisyonu göstermezler. Küçük yuvarlak hücreler kırmızı kan hücreleri vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verim ikincil tümör oluşumu aşağıdaki gibidir allografting başarılı medulloblastom hücre sağlamak için birkaç kritik faktörler: Birincisi, sadece doku disosiasyon için% 50 Accutase kullanımı ve uzun süreli enzim tedavisi hücre canlılığını anlamlı bir azalma yol olarak doku üzerinde sindirimi yoktur. Ayrıca sadece 1 mL boyutu Pipetman küçük ipuçları da ayrışmış hücreleri fiziksel hasar oluşturabilir kullanın. Allografting için tek hücreler ve küçük agrega karışımı ince. İkincisi, Hamilton şırınga yüklemeden önce karıştırın ve tümör hücre çözümü her zaman dengeye. Daha büyük bir hacmi çok fazla kafa içi basınç ve direnç oluşturmak olduğu gibi, her enjeksiyon için en fazla 4 mcL kullanmayın. Son olarak, her enjeksiyondan sonra serebellar doku içine enjekte çözüm dağıtmak için ek bir 2 dakika beklemek önemlidir.
Burada anlatılan prosedürler, genetik olarak işaretlenmiş hücre tipi (ler) tümörler başlatmak ve yaymak belirlenmesi için izin. Bu protokol enjekte edilecek primer tümör dokusu hücreleri doğrudan elde edilmeyen durumlar için de geçerlidir, fakat kurulan kültür hücre hatları. Bir enzim sindirimi ve / veya tekrarlayan pipetleme uygun sayıda hücre hazırlamak ve bu protokolün 2. Adım başlamak. Bu nedenle, biz de aday genler işlevleri ve in vivo tümör büyüme okuma bir kimyasal bileşiklerin inhibitör etkisi test edebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışmada, Vanderbilt-Ingram Kanser Merkezi Destek Hibe (P30 CA068485), Çocukluk Çağı Beyin Tümörü Vakfı ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NS042205) hibe ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | 51730 | |
| Foredom flexible shaft drill, hang-up style | Stoelting Co. | 58650 | |
| Large probe holder | Stoelting Co. | 51633 | |
| 10 μL syringe, 26 ga., bevel tip | Stoelting Co. | 51105 | |
| Drill bit .75mm | Stoelting Co. | 51455-3 |
References
- Schuller, U. Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma. Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).
- Yang, Z. J. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Kessler, J. D. N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma. Genes Dev. 23, 157-170 (2009).
- Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
- Salsano, E. Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1. Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).
