Summary
En este vídeo se utiliza un adenovirus que porta el gen de la recombinasa Cre para infectar fibroblastos primarios de embriones de ratón que lleva un alelo floxed Rac1.
Abstract
La capacidad de eliminar genéticamente los componentes específicos de las diversas cascadas de señalización celular ha sido una herramienta fundamental en el análisis moderno de transducción de señales. Un método particular para lograr la supresión condicional es a través de la utilización del sistema Cre-loxP. Este método consiste en que flanquean el gen de interés con los sitios loxP, que son secuencias específicas de reconocimiento para la proteína recombinasa Cre. La exposición de los llamados floxed (flanqueado por sitios loxP) del ADN de esta enzima provoca un evento de recombinación Cre-mediada en los sitios loxP, y la escisión posterior de los genes que intervienen 3. Diferentes métodos existentes para administrar la recombinasa Cre en el sitio de interés. En este vídeo, que muestran el uso de un adenovirus que contiene el gen de la recombinasa Cre para infectar fibroblastos primarios de embriones de ratón (MEFs) obtenidas de embriones que contienen una floxed Rac1 alelo 1. Nuestra razón de ser para la selección de Rac1 MEFs para nuestros experimentos es que los cambios morfológicos claros se puede ver a la supresión de Rac1, debido a alteraciones en el citoesqueleto de actina a 2,5. 72 horas después de la transducción viral y la expresión de Cre, las células fueron teñidas con tinte phalloidin la actina y la imagen por microscopía confocal de barrido láser. Se observó que MEFs que habían estado expuestos al virus adeno-Cre aparecieron contratados y en la morfología alargada en comparación con las células no infectadas, de acuerdo con los informes anteriores 2,5. El método de adenovirus Cre recombinasa entrega es una ventaja ya que el virus adeno-Cre está fácilmente disponible, y la supresión de genes a través de Cre en casi el 100% de las células se puede lograr con la infección por adenovirus optimizado.
Protocol
Las células de descongelación
- Obtener los fibroblastos congelados embriones de ratón (MEFs) (generado previamente del cultivo de embriones primarios individuales) a partir de nitrógeno líquido.
- Descongelar las células mediante la inmersión en el vial a 37 ° C con agitación hasta que se hayan descongelado por completo.
- Añadir 9 ml de DMEM que se ha complementado con suero fetal bovino al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina a una placa de cultivo celular de 10 cm.
- Añadir la suspensión de células descongeladas, gota a gota a la placa, el rock suavemente la placa para dispersar las células de la placa y refrigerarla en un 37 ° C CO, 5% 2 incubadora durante la noche. Tenga en cuenta que si las células son sensibles a DMSO (del proceso de congelación), los medios de comunicación inicial puede ser sustituido por medio fresco después que las células se han adherido a la placa (aproximadamente cuatro horas después de la chapa). También tenga en cuenta que la confluencia de las células después de la descongelación dependerá del número de células congeladas, la tasa de recuperación de las células después de la congelación, y la tasa de crecimiento de las células.
Las células de los pases
- Cuando las células han llegado a prácticamente el 100% de confluencia (por ejemplo: al día siguiente), aspirado de los medios de comunicación y lavar las células con 5 ml de PBS estéril.
- Quitar PBS y añadir 1 ml de tripsina que contiene 10 mM EDTA y la placa de lugar en la incubadora durante unos 5 minutos para permitir que las células se desprenden de la placa.
- Cuando las células se han desprendido, agregar 9 ml de los medios de comunicación a las células con tripsina, pipeta de 3.2 veces para dispersar a grupos, añadir 1 ml de esta suspensión, gota a gota en un plato nuevo que contiene 9 ml de los medios de comunicación, y este lugar en los 37 ° C incubadora durante la noche . La presencia de FBS en los medios de inactivar la tripsina, alternativamente, las células se pueden lavar primero a diluir la tripsina.
Conteo de células y placas en la cubierta se desliza
- Eliminar las células de la incubadora, lavar y trypsinize como antes, excepto que esta vez añadir 5-6 ml medios de comunicación de nuevo a las células con tripsina en lugar de 9 ml.
- Las células con una pipeta a fondo para asegurar la disociación completa en una única suspensión de células, y extraer 15μL para combinar con 15μL de azul tripán en un tubo de microcentrífuga separados.
- Mezclar esta suspensión celular / azul tripán pipeteando arriba y abajo varias veces, y añadir 15μL del hemocitómetro.
- Bajo el microscopio, las células muertas que aparecen en azul. Cuente el número de células claras / incoloro (que viven) en una de las redes de 4X4 en el hemocitómetro. Repita este cuenta con las otras tres redes de 4X4 (denominado A, B, C y D) y el uso de la siguiente ecuación para calcular el número de células por microlitro de la suspensión:
- A través de la optimización del protocolo, hemos determinado que el recubrimiento 30.000 resultados células de la densidad celular apropiada para la visualización a la conclusión del experimento.
- Para calcular el volumen de suspensión celular necesario para 30.000 celdas, utilice la siguiente ecuación:
- A continuación, coloque una hoja de cubierta de vidrio estéril en cada pocillo de una placa de seis bien y añadir 2 ml de los medios de comunicación a cada pocillo, y luego añadir, gota a gota de la suspensión de su celular el volumen requerido por 30.000 células en cada pocillo. Tenga en cuenta que se desliza cubierta de vidrio se utilizan para este experimento que vamos a visualizar las células mediante microscopía de fluorescencia en un momento posterior, no todas las aplicaciones necesariamente requerirá de la microscopía, y por lo tanto la cubierta se desliza puede no ser necesaria.
Virus de transducción
- Después de varias horas o (tiempo suficiente para asegurar que las células se adhieren a la cubierta se desliza) durante la noche, retire el material y lavar las células con 1 ml de suero libre de DMEM.
- Añadir 1 ml de medio libre de suero a cada pocillo de la adición de los virus. Para este experimento, adeno-Cre virus se obtuvo comercialmente de Biolabs Vector.
- Optimización de protocolos anteriores han demostrado que una multiplicidad de infección (MOI), de 500 proporciona transducción de genes de alta eficiencia en la atención primaria MEFs con poco o ningún efecto sobre la viabilidad celular. MOI se puede calcular de la siguiente manera:
- Agregar el volumen calculado de virus directamente a cada uno, así que va a ser infectados, agite suavemente la placa para dispersar a los virus de las células y el lugar en la incubadora a 37 ° C durante la noche.
- A la mañana siguiente, eliminar el virus que contienen los medios de comunicación de las células y lavar las células en 1 ml de PBS estéril y luego agregar 2 ml de los medios de comunicación regulares para cada pozo.
- En el caso de las células de Rac1 se ejemplifica en este experimento, se produjeron cambios morfológicos en las células en aproximadamente 72 horas después de transducción.
Resultados representante
Las células se visualizand mediante la tinción con el colorante phalloidin actina (a efectos de imágenes solamente) y la imagen con el Leica TCS-SP5 multifotónica microscopio láser confocal de barrido en el Centro de Análisis Avanzados de la Universidad de Guelph. La figura 1 muestra la morfología alargada y contratados de la Rac1 flox / flox células que fueron expuestos a virus adeno-Cre en comparación con las mismas células no expuestas al virus.
Figura 1. Comparación entre Rac1 flox / flox células infectadas con virus adeno-Cre (izquierda) en comparación con las células no infectadas de la misma fuente (derecha).
Discussion
El video que acompaña un ejemplo de cómo un virus recombinante se puede utilizar para extirpar un gen específico in vitro utilizando la recombinasa Cre. El desarrollo de este protocolo sin embargo, puso de manifiesto algunos puntos en particular vale la pena abordar.
- Los procedimientos de seguridad siempre se debe emplear cuando se trabaja con adenovirus. Una bata de laboratorio y se deben usar guantes en todo momento mientras trabaja con el virus. Los medios de comunicación y artículos de plástico deben ser tratados con lejía al 10% por lo menos durante 30 minutos, y utensilios de plástico deben ser esterilizados en autoclave a partir de entonces.
- Evitar la repetición de congelación-descongelación del stock de virus ya que esto puede afectar a título de virus y por lo tanto reducen la eficiencia de transducción. Pequeñas cantidades de stock de virus debe ser, inicialmente alícuotas en tubos separados.
- MOI que van desde 50 hasta 500 fueron probados durante el desarrollo del método y las tasas de eficiencia de transducción se observaron en la mayoría de los casos, sin efectos negativos sobre la viabilidad celular.
- Adeno-GFP se utilizó también durante el desarrollo de métodos para detectar rápidamente la eficiencia de transducción. Este control (o un vector vacío) debe llevarse a cabo durante el experimento para asegurarse de que la infección viral por sí sola no resultará en cambios celulares. Del mismo modo, si la escisión del gen floxed de interés en sus células no se traduce en cambios celulares (es decir, cambios en la morfología o la viabilidad), y luego infectan el mismo tipo de células con virus adeno-GFP es un control importante utilizar para demostrar que la transducción de virus ocurriendo.
Más allá del examen de las cascadas de señalización en la cultura, el enfoque de adeno-Cre también se ha empleado en vivo para eliminar condicionalmente genes de animales de experimentación 3,4, y para marcar poblaciones específicas de células de un organismo 6. El sistema de adenovirus también puede ser adaptado para introducir otros genes de la recombinasa Cre en las células huésped. Dos principales ventajas de la utilización de este vector de entrega son sus transducción de alta eficiencia y la entrega de genes, y la falta de integración con el ADN del huésped. Sin embargo, la generación de nuevos adenovirus recombinante puede ser mano de obra intensiva. El protocolo descrito aquí por lo tanto, aprovecha la potencia del sistema adenoviral mediante la explotación de los desarrollados anteriormente adeno-Cre virus, y el acoplamiento que con nuestro alelo floxed de interés, Rac1. A través de esta llamada condicional a cabo el experimento, hemos confirmado que la transducción con el virus adeno-Cre de MEFs que lleva un alelo Rac1 floxed en verdad causa la escisión de Rac1 que conducen a los cambios en la morfología celular característica de las células deficientes en Rac1 2,5.
Disclosures
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Consejo Canadiense de los Animales.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. Rizaldy Scott en el Hospital Mount Sinai en Toronto, Ontario por su don de la primaria Rac1 fibroblastos flox / flox de embriones de ratón. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de funcionamiento para NJ de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR, 2009-93.526 MOP) y el de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC, RG 327372 a 06). SH y MW son apoyados por CGSMA y M-CGS premios de CIHR y NSERC, respectivamente.
Steve Hawley Testamentos y Melanie contribuyeron igualmente a este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad-CMV-Cre virus | Vector Biolabs | 1045 | |
| DME High glucose media 500mL | Fisher Scientific | SH3002201 | |
| FBS Canadian origin 500mL | VWR international | CAA15-701 | |
| PEN-STREP 1X solution 100mL | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Texas Red-X phalloidin | Invitrogen | T7471 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4549 |
References
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