Summary
في هذا الفيديو نستخدم اتش تحمل الجينات recombinase لجنة المساواة العرقية لتصيب الخلايا الليفية الماوس الأولية الجنينية يحمل floxed Rac1 أليل.
Abstract
وقد القدرة على إزالة عناصر محددة وراثيا من مختلف شلالات يشير خلية أداة متكاملة في الحديث إشارة تحليل تنبيغ. أسلوب واحد معين لتحقيق هذا الحذف الشرطي هو من خلال استخدام نظام لجنة المساواة العرقية ، loxP. هذا الأسلوب ينطوي المرافقة الجين في المصالح مع مواقع loxP ، والتي هي الاعتراف متواليات محددة للبروتين recombinase لجنة المساواة العرقية. تعرض الحمض النووي يسمى (محاط موقع loxP) floxed لهذا الانزيم النتائج في حال إعادة التركيب بوساطة لجنة المساواة العرقية في مواقع loxP ، والاستئصال لاحقة من الجينات المتدخلة 3. توجد عدة طرق مختلفة لإدارة لجنة المساواة العرقية recombinase الى موقع الفائدة. في هذا الفيديو ، ونحن لشرح استخدام لتحتوي على جينات الفيروس الغدي recombinase لجنة المساواة العرقية لتصيب الخلايا الليفية الماوس الأولية الجنينية (MEFs) تم الحصول عليها من الأجنة التي تحتوي على floxed Rac1 أليل 1. الأساس المنطقي لدينا لاختيار Rac1 MEFs عن تجاربنا هو أنه يمكن أن ينظر إلى تغيرات شكلية واضحة على حذف Rac1 ، وذلك بسبب التعديلات في الهيكل الخلوي أكتين 2،5. 72 ساعة التالية تنبيغ الفيروسية والتعبير لجنة المساواة العرقية ، تم صبغ الخلايا باستخدام الصبغة أكتين phalloidin والتقط باستخدام المجهر متحد البؤر المسح بالليزر. لوحظ أن MEFs التي تعرضت لهذا الفيروس ظهر لجنة المساواة العرقية الغدة التعاقد وممدود في التشكل مقارنة مع الخلايا غير المصابة ، بما يتفق مع التقارير السابقة 2،5. أسلوب التسليم اتش recombinase لجنة المساواة العرقية هو مفيد مثل فيروس الغدة لجنة المساواة العرقية هي متاحة بسهولة ، ويمكن أن يتحقق عن طريق حذف الجينات لجنة المساواة العرقية في ما يقرب من 100 ٪ من الخلايا مع عدوى الفيروسة الغدانية الأمثل.
Protocol
ذوبان الخلايا
- الحصول على الخلايا الليفية الماوس الجنينية المجمدة (MEFs) (ولدت في وقت سابق من الثقافات الفردية الأولية الجنين) من النيتروجين السائل.
- ذوبان الجليد عن طريق غمر خلايا فيال في 37 درجة مئوية مع دوامات المياه حتى يتم إذابة محتويات تماما.
- إضافة 9mL DMEM من أنه قد تم استكمال 10 ٪ من مصل بقري جنيني و 1 ٪ البنسلين الستربتوميسين إلى ثقافة وحة 10cm الخلية.
- إضافة تعليق إذابة الخلايا المنسدلة الحكيمة لوحة ، لوحة الروك برفق لتفريق الخلايا ومكان في لوحة 37 درجة مئوية ثاني ، و 5 ٪ 2 حاضنة بين عشية وضحاها. علما انه اذا خلايا حساسة للDMSO (من عملية التجميد) ، يمكن استبدال وسائل الاعلام مع وسائل الاعلام الأولي خلايا جديدة بعد انضمت الى لوحة (ما يقرب من اربع ساعات طلاء آخر). نلاحظ أيضا أن التقاء الخلايا بعد ذوبان يعتمد على عدد من الخلايا المجمدة ، ومعدل الشفاء من الخلايا بعد التجميد ، ومعدل نمو الخلايا.
الركض الخلايا
- عندما نمت الخلايا أساسا إلى 100 ٪ confluency (أي : في اليوم التالي) ، قبالة نضح وسائل الإعلام وغسل الخلايا مع 5mL من برنامج تلفزيوني العقيمة.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1mL من التربسين التي تحتوي على لوحة 10MM EDTA ومكان في حاضنة لحوالي 5 دقائق للسماح لفصل الخلايا من لوحة.
- عندما يكون فصل الخلايا ، إضافة إلى وسائل الإعلام 9mL الخلايا trypsinized ، ماصة 2-3 مرات لتفريق كتل ، إضافة 1mL هذا التعليق الانقطاع عن الحكمة على لوحة جديدة تحتوي على 9mL وسائل الإعلام ، وهذا المكان في 37 درجة مئوية خلال الليل حاضنة . وجود FBS في وسائل الإعلام يعطل التربسين وبدلا من ذلك ، يمكن غسلها الخلايا الأولى للتخفيف من والتربسين.
العد وطلاء الخلايا على تغطية زلات
- إزالة الخلايا من الحاضنة ، وغسل ويعرض للتريبسين كما كان من قبل ، باستثناء هذه المرة إضافة 5 - 6mL وسائل الاعلام الى خلايا trypsinized بدلا من 9mL.
- خلايا ماصة بدقة للتأكد من التفكك الكامل في تعليق خلية واحدة ، وإزالة 15μL لتتحد مع 15μL التريبان الأزرق في أنبوب microfuge منفصلة.
- خلط هذا التعليق الخلية / التريبان الأزرق بواسطة pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات ، وإضافة إلى 15μL عدادة الكريات.
- تحت المجهر ، وسوف تظهر الخلايا الميتة زرقاء. حساب عدد الخلايا واضحة / عديم اللون (يعيشون) في واحدة من شبكات 4X4 على عدادة الكريات. كرر هذا الاعتماد على شبكات أخرى three 4X4 (A الرمز ، B ، C و D) واستخدام المعادلة التالية لحساب عدد الخلايا لكل ميليلتر من التعليق :
- من خلال التحسين البروتوكول ، وقد توصلنا إلى أن الخلايا النتائج 30000 الطلاء في كثافة الخلية المناسبة لتصور في ختام التجربة.
- لحساب حجم الخلية تعليق اللازمة للخلايا 30000 ، استخدام المعادلة التالية :
- المكان الآن غطاء زجاجي معقم الانزلاق في كل بئر من صحن six جيدا وإضافة إلى وسائل الإعلام 2mL كل بئر ، ومن ثم إضافة قطرة من الحكمة من الايقاف الخاص حجم الخلية المطلوبة ل30000 الخلايا في كل بئر. علما بأن تستخدم غطاء زجاجي زلات لهذه التجربة ونحن سوف تصور الخلايا باستخدام المجهر مضان في نقطة وقت لاحق ، ليست كل الطلبات سوف يتطلب بالضرورة المجهري ، وبالتالي قد لا تغطي زلات تكون مطلوبة.
فيروس تنبيغ
- بعد عدة ساعات أو (ما يكفي من الوقت للتأكد من أن الخلايا الالتزام ينزلق الغطاء) بين عشية وضحاها ، وإزالة وسائل الاعلام وغسل الخلايا مع 1mL المصل خالية DMEM.
- إضافة 1mL المصل خالية من وسائل الإعلام إلى كل خير لكما من الفيروس. عن هذه التجربة ، تم الحصول على الغدة فيروس تجاريا من لجنة المساواة العرقية Biolabs المتجهات.
- وقد أظهرت السابقة التحسين البروتوكول الذي وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 500 يوفر كفاءة عالية في تنبيغ الجينات MEFs الأولية مع تأثير ضئيل او لا على بقاء الخلية. ويمكن حساب وزارة الداخلية على النحو التالي :
- إضافة الحجم المحسوب الفيروس مباشرة إلى كل بئر إلى أن تكون مصابة ، الصخرة بلطف لوحة لتفريق الخلايا وفيروس مكان في الحاضنة 37 درجة مئوية خلال الليل.
- في صباح اليوم التالي ، إزالة الفيروس التي تحتوي على وسائل الاعلام من الخلايا والخلايا في غسل 1mL العقيمة PBS ثم إضافة 2mL من وسائل الإعلام العادية إلى كل بئر.
- في حالة الخلايا Rac1 يتجلى في هذه التجربة ، حدثت تغييرات شكلية في الخلايا في حوالي 72 ساعة تنبيغ آخر.
ممثل النتائج
وكانت الخلايا تصورد عن طريق تلوين مع phalloidin صبغ أكتين (لأغراض التصوير فقط) والتقط باستخدام TCS - SP5 ايكا الليزر مبائر multiphoton مجهر المسح في مركز التحليل المتقدمة في جامعة جويلف. الشكل 1 يبين التعاقد مورفولوجيا وممدود من الخلايا flox / flox Rac1 التي تعرضت للفيروس الغدة لجنة المساواة العرقية مقارنة مع نفس الخلايا لا يتعرض للفيروس.
الشكل 1. مقارنة بين الخلايا flox / flox Rac1 المصابين بفيروس الغدة لجنة المساواة العرقية (يسار) بالمقارنة مع الخلايا غير المصابة من نفس المصدر (يمين).
Discussion
شريط الفيديو المرافق يوضج كيف يمكن استخدام الفيروس المؤتلف لجينة محددة المكوس في المختبر باستخدام recombinase لجنة المساواة العرقية. وضع هذا البروتوكول لم تكشف إلا بعض نقاط معينة تستحق معالجة.
- وينبغي دائما أن تكون إجراءات السلامة المناسبة المستخدمة عند العمل مع الفيروسات الغدية. وينبغي ارتداء معطف المختبر والقفازات في جميع الأوقات بينما كان يعمل مع الفيروس. ينبغي أن تعامل وسائل الإعلام والأدوات البلاستيكية التي تحتوي على مواد التبييض 10 ٪ لمدة لا تقل عن 30 دقيقة ، ويجب تعقيمها البلاستيكية بعد ذلك.
- تجنب تكرار تجميد ذوبان المخزون الفيروس حيث أن هذا الفيروس يمكن أن تؤثر على عيار وبالتالي تقليل كفاءة تنبيغ. وينبغي في البداية كميات صغيرة من الأسهم يكون الفيروس aliquoted في أنابيب منفصلة.
- تم اختبار موييس تتراوح 5-50 خلال تطوير أسلوب وشوهدت تنبيغ معدلات الكفاءة في معظم الحالات ، من دون آثار سلبية على بقاء الخلية.
- كما تم استخدام الغدة GFP خلال تطوير أسلوب الشاشة بسرعة تنبيغ الكفاءة. ينبغي أن تجرى هذه السيطرة (أو ناقل فارغ) خلال التجربة للتأكد من أن العدوى الفيروسية وحدها لا تؤدي إلى تغييرات الخلوية. وبالمثل ، إذا كان استئصال الجين floxed الفائدة في خلايا الجسم لا ينتج أي تغييرات الخلوية (أي تغييرات في التشكل أو البقاء) ، ثم اصابة نوع الخلية نفسها مع الغدة GFP هو عنصر تحكم المهم استخدام لإثبات أن الفيروس تنبيغ تحدث.
ما وراء فحص الإشارات شلالات في الثقافة ، كما تم النهج الغدة لجنة المساواة العرقية الذين يعملون في الجسم الحي لإزالة مشروط جينات من حيوانات التجارب 3،4 ، وتسمية مجموعات سكانية محددة من خلايا الكائن الحي داخل 6. ويمكن أيضا لنظام اتش تكييفها لإدخال جينات أخرى من لجنة المساواة العرقية في recombinase الخلايا المضيفة. ميزتان الرئيسية لاستخدام هذه النواقل هي التسليم تنبيغ العالية والكفاءة في الجينات التسليم ، وانعدام التكامل مع الحمض النووي المضيف. ومع ذلك ، يمكن لجيل من الفيروسات الغدية المؤتلف الرواية تكون كثيفة العمالة. بروتوكول الموصوفة هنا يسخر بالتالي قوة للنظام من خلال استغلال الفيروسة الغدانية التي سبق وضعها لجنة المساواة العرقية الغدة الفيروس ، واقتران ذلك مع أليل دينا floxed المصالح ، Rac1. من خلال هذا الشرطي يطرق خارج التجربة ، وأكد لنا ان تنبيغ باستخدام فيروس الغدة من لجنة المساواة العرقية MEFs يحمل أليل Rac1 floxed يسبب فعلا استئصال Rac1 تؤدي إلى تغييرات في الخصائص التشكل الخلوي للخلايا التي تعاني من نقص Rac1 2،5.
Disclosures
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعها المجلس الكندي لرعاية الحيوان.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور سكوت Rizaldy في مستشفى ماونت سيناي في تورونتو ، أونتاريو لهديته من الأساسي Rac1 flox / flox الليفية الجنينية الماوس. وأيد هذا العمل من خلال العمل على منح NJ من المعاهد الكندية للأبحاث الصحية (CIHR ، MOP 2009-93526) والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC ، RG 327372-06). ويتم دعم SH ميجاوات بحلول CGSMA CGS - M وجوائز من وCIHR NSERC ، على التوالي.
وساهم ستيف هولي ميلاني الوصايا بالتساوي على هذه الورقة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad-CMV-Cre virus | Vector Biolabs | 1045 | |
| DME High glucose media 500mL | Fisher Scientific | SH3002201 | |
| FBS Canadian origin 500mL | VWR international | CAA15-701 | |
| PEN-STREP 1X solution 100mL | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Texas Red-X phalloidin | Invitrogen | T7471 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4549 |
References
- Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly. J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).
- Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions. J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).
- Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion. Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).
- Rijnkels, M., Rosen, J. M. Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells. J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).
- Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor. Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).
- Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus. Genesis. 44, 51-56 (2006).
