اتش بوساطة إزالة الجزيئات الجينية في اشارة الى مثقف الخلايا الليفية الماوس الأولية الجنينية
Summary
في هذا الفيديو نستخدم اتش تحمل الجينات recombinase لجنة المساواة العرقية لتصيب الخلايا الليفية الماوس الأولية الجنينية يحمل floxed Rac1 أليل.
Abstract
وقد القدرة على إزالة عناصر محددة وراثيا من مختلف شلالات يشير خلية أداة متكاملة في الحديث إشارة تحليل تنبيغ. أسلوب واحد معين لتحقيق هذا الحذف الشرطي هو من خلال استخدام نظام لجنة المساواة العرقية ، loxP. هذا الأسلوب ينطوي المرافقة الجين في المصالح مع مواقع loxP ، والتي هي الاعتراف متواليات محددة للبروتين recombinase لجنة المساواة العرقية. تعرض الحمض النووي يسمى (محاط موقع loxP) floxed لهذا الانزيم النتائج في حال إعادة التركيب بوساطة لجنة المساواة العرقية في مواقع loxP ، والاستئصال لاحقة من الجينات المتدخلة 3. توجد عدة طرق مختلفة لإدارة لجنة المساواة العرقية recombinase الى موقع الفائدة. في هذا الفيديو ، ونحن لشرح استخدام لتحتوي على جينات الفيروس الغدي recombinase لجنة المساواة العرقية لتصيب الخلايا الليفية الماوس الأولية الجنينية (MEFs) تم الحصول عليها من الأجنة التي تحتوي على floxed Rac1 أليل 1. الأساس المنطقي لدينا لاختيار Rac1 MEFs عن تجاربنا هو أنه يمكن أن ينظر إلى تغيرات شكلية واضحة على حذف Rac1 ، وذلك بسبب التعديلات في الهيكل الخلوي أكتين 2،5. 72 ساعة التالية تنبيغ الفيروسية والتعبير لجنة المساواة العرقية ، تم صبغ الخلايا باستخدام الصبغة أكتين phalloidin والتقط باستخدام المجهر متحد البؤر المسح بالليزر. لوحظ أن MEFs التي تعرضت لهذا الفيروس ظهر لجنة المساواة العرقية الغدة التعاقد وممدود في التشكل مقارنة مع الخلايا غير المصابة ، بما يتفق مع التقارير السابقة 2،5. أسلوب التسليم اتش recombinase لجنة المساواة العرقية هو مفيد مثل فيروس الغدة لجنة المساواة العرقية هي متاحة بسهولة ، ويمكن أن يتحقق عن طريق حذف الجينات لجنة المساواة العرقية في ما يقرب من 100 ٪ من الخلايا مع عدوى الفيروسة الغدانية الأمثل.
Protocol
Discussion
شريط الفيديو المرافق يوضج كيف يمكن استخدام الفيروس المؤتلف لجينة محددة المكوس في المختبر باستخدام recombinase لجنة المساواة العرقية. وضع هذا البروتوكول لم تكشف إلا بعض نقاط معينة تستحق معالجة.
- وينبغي دائما أن تكون إجراءات السلامة المناسبة المستخدمة عند العمل مع الفيروسات الغدية. وينبغي ارتداء معطف المختبر والقفازات في جميع الأوقات بينما كان يعمل مع الفيروس. ينبغي أن تعامل وسائل الإعلام والأدوات البلاستيكية التي تحتوي على مواد التبييض 10 ٪ لمدة لا تقل عن 30 دقيقة ، ويجب تعقيمها البلاستيكية بعد ذلك.
- تجنب تكرار تجميد ذوبان المخزون الفيروس حيث أن هذا الفيروس يمكن أن تؤثر على عيار وبالتالي تقليل كفاءة تنبيغ. وينبغي في البداية كميات صغيرة من الأسهم يكون الفيروس aliquoted في أنابيب منفصلة.
- تم اختبار موييس تتراوح 5-50 خلال تطوير أسلوب وشوهدت تنبيغ معدلات الكفاءة في معظم الحالات ، من دون آثار سلبية على بقاء الخلية.
- كما تم استخدام الغدة GFP خلال تطوير أسلوب الشاشة بسرعة تنبيغ الكفاءة. ينبغي أن تجرى هذه السيطرة (أو ناقل فارغ) خلال التجربة للتأكد من أن العدوى الفيروسية وحدها لا تؤدي إلى تغييرات الخلوية. وبالمثل ، إذا كان استئصال الجين floxed الفائدة في خلايا الجسم لا ينتج أي تغييرات الخلوية (أي تغييرات في التشكل أو البقاء) ، ثم اصابة نوع الخلية نفسها مع الغدة GFP هو عنصر تحكم المهم استخدام لإثبات أن الفيروس تنبيغ تحدث.
ما وراء فحص الإشارات شلالات في الثقافة ، كما تم النهج الغدة لجنة المساواة العرقية الذين يعملون في الجسم الحي لإزالة مشروط جينات من حيوانات التجارب 3،4 ، وتسمية مجموعات سكانية محددة من خلايا الكائن الحي داخل 6. ويمكن أيضا لنظام اتش تكييفها لإدخال جينات أخرى من لجنة المساواة العرقية في recombinase الخلايا المضيفة. ميزتان الرئيسية لاستخدام هذه النواقل هي التسليم تنبيغ العالية والكفاءة في الجينات التسليم ، وانعدام التكامل مع الحمض النووي المضيف. ومع ذلك ، يمكن لجيل من الفيروسات الغدية المؤتلف الرواية تكون كثيفة العمالة. بروتوكول الموصوفة هنا يسخر بالتالي قوة للنظام من خلال استغلال الفيروسة الغدانية التي سبق وضعها لجنة المساواة العرقية الغدة الفيروس ، واقتران ذلك مع أليل دينا floxed المصالح ، Rac1. من خلال هذا الشرطي يطرق خارج التجربة ، وأكد لنا ان تنبيغ باستخدام فيروس الغدة من لجنة المساواة العرقية MEFs يحمل أليل Rac1 floxed يسبب فعلا استئصال Rac1 تؤدي إلى تغييرات في الخصائص التشكل الخلوي للخلايا التي تعاني من نقص Rac1 2،5.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور سكوت Rizaldy في مستشفى ماونت سيناي في تورونتو ، أونتاريو لهديته من الأساسي Rac1 flox / flox الليفية الجنينية الماوس. وأيد هذا العمل من خلال العمل على منح NJ من المعاهد الكندية للأبحاث الصحية (CIHR ، MOP 2009-93526) والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC ، RG 327372-06). ويتم دعم SH ميجاوات بحلول CGSMA CGS – M وجوائز من وCIHR NSERC ، على التوالي.
وساهم ستيف هولي ميلاني الوصايا بالتساوي على هذه الورقة.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ad-CMV-Cre virus | Vector Biolabs | 1045 | ||
| DME High glucose media 500mL | Fisher | SH3002201 | ||
| FBS Canadian origin 500mL | VWR | CAA15-701 | ||
| PEN-STREP 1X solution 100mL | Fisher | SV30010 | ||
| Texas Red-X phalloidin | Invitrogen | T7471 | ||
| Trypsin | Sigma | T4549 |
References
- Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly. J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).
- Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. o. w. n. e. y., Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions. J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).
- Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion. Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).
- Rijnkels, M., Rosen, J. M. Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells. J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).
- Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor. Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).
- Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus. Genesis. 44, 51-56 (2006).
