在这个视频中,我们使用一种腺病毒携带的Cre重组酶基因感染主要滑鼠胚胎成纤维细胞携带一个floxed Rac1的等位基因。
基因去除各种细胞信号级联的具体组成部分的能力已经在现代信号转导分析的一个不可或缺的工具。通过的Cre – loxP系统的使用是一个特别的方法来实现这个条件删除。这种方法涉及到与loxP位点,Cre重组蛋白的特异性识别序列的侧翼感兴趣的基因。这种酶在Cre介导的loxP位点的重组事件,以及随后切除干预基因 3结果显示,所谓的floxed(两侧loxP位网站)的DNA曝光。存在几种不同的方法来管理Cre重组酶的兴趣网站。在这个视频中,我们展示了使用含有Cre重组酶基因的腺病毒,感染主要小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)从含有一个floxed Rac1的等位基因1胚胎获得。我们选择我们的实验中,Rac1的MEFs理据是明确的形态学变化,可以看到后删除Rac1 的 ,由于2,5中的肌动蛋白细胞骨架的改变。 72小时后病毒转导和表达的Cre,细胞染色使用的肌动蛋白染料鬼笔环肽和使用激光扫描共聚焦显微镜成像。据观察,MEFs曾暴露于腺的Cre病毒出现收缩和拉长未受感染的细胞相比,在形态,与以前的2,5报告一致。 Cre重组酶的腺病毒传递的方法是有利的,因为的腺Cre重组病毒很容易使用,可实现优化的腺病毒感染和通过的Cre基因的缺失,在近100%的细胞。
影随行,充分体现了如何可用于消费特定的基因在体外利用Cre重组酶的重组病毒。本议定书的发展,但是没有揭示值得解决一些特定的点。
腺的Cre方法的信号级联文化考试之外,还聘请有条件删除从3,4实验动物的基因,和标签 6一个有机体的细胞内特定人群体内。腺病毒载体系统,也可以适应引进比Cre重组酶的基因进入宿主细胞。使用这种传送载体的主要优点是其高转导和基因传递的效率,并缺乏与宿主DNA整合。然而,一代新型重组腺病毒可以是劳动密集型。这里所描述的协议,因此线束利用以前开发的腺Cre重组病毒腺病毒系统的电源,和耦合,与我们的利益,RAC1 floxed等位基因。通过这出实验条件敲,我们已经证实,使用MEFs背着floxed Rac1的等位基因腺Cre重组病毒转导确实造成Rac1的切除,导致细胞形态特征Rac1的缺陷细胞 2,5的变化。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢在西奈山医院在多伦多,安大略省Rizaldy斯科特博士为他的主RAC1 flox / flox小鼠胚胎成纤维细胞的礼物。这项工作是支持由加拿大卫生研究所(CIHR,2009-93526澳门元)及自然科学和加拿大工程研究理事会(NSERC,RG 327372-06)研究所的资助,以新泽西州经营。 SH和MW CGSMA和CGS – M的奖项,分别从CIHR和NSERC支持。
史蒂夫霍利和梅拉妮遗嘱本文同等贡献。