इस वीडियो में हम एक adenovirus Cre recombinase प्राथमिक माउस भ्रूणीय floxed Rac1 एलील ले fibroblasts संक्रमित जीन ले जाने का उपयोग करें.
आनुवंशिक रूप से विभिन्न सेल संकेतन cascades की विशिष्ट घटकों को दूर करने की क्षमता आधुनिक संकेत transduction विश्लेषण में अभिन्न उपकरण किया गया है. इस सशर्त विलोपन को प्राप्त करने के एक विशेष विधि Cre – loxP प्रणाली के उपयोग के माध्यम से है. इस विधि loxP साइटों, जो Cre recombinase प्रोटीन के लिए विशिष्ट मान्यता दृश्यों के साथ ब्याज की जीन flanking शामिल है. Cre की मध्यस्थता loxP साइटों पर पुनर्संयोजन घटना है, और बीच 3 जीन के बाद छांटना में इस एंजाइम परिणामों के तथाकथित floxed डीएनए (loxP साइट द्वारा flanked) के एक्सपोजर. कई अलग अलग तरीकों के लिए ब्याज की साइट Cre recombinase प्रशासन मौजूद हैं. इस वीडियो में, हम एक Cre recombinase संक्रमित प्राथमिक माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts floxed Rac1 1 एलील युक्त भ्रूण से प्राप्त जीन युक्त adenovirus का उपयोग प्रदर्शित करता है. हमारे प्रयोगों के लिए Rac1 MEFs का चयन करने के लिए हमारी तर्क यह है कि स्पष्ट morphological परिवर्तन Rac1 का विलोपन, actin cytoskeleton 2,5 में परिवर्तन के कारण पर देखा जा सकता है है. वायरल पारगमन और Cre अभिव्यक्ति के बाद 72 घंटे, कोशिकाओं का उपयोग actin डाई phalloidin दाग थे और लेजर confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged. यह देखा गया है कि MEFs जो एडिनो – Cre वायरस को उजागर किया गया था अनुबंधित और दर्शन आकारिकी में लम्बी असंक्रमित कोशिकाओं की तुलना में, पिछले 2,5 रिपोर्ट के साथ संगत . Cre recombinase प्रसव के adenovirus विधि फायदेमंद है के रूप में एडिनो – Cre वायरस आसानी से उपलब्ध है, और जीन विलोपन Cre के माध्यम से कोशिकाओं के लगभग 100% में अनुकूलित adenoviral संक्रमण के साथ प्राप्त किया जा सकता है.
साथ वीडियो मिसाल है कि कैसे एक रीकॉम्बीनैंट वायरस उत्पाद इन विट्रो में एक विशेष जीन Cre recombinase का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लेकिन इस प्रोटोकॉल के विकास को संबोधित लायक कुछ विशेष अंक प्रकट किया.
संस्कृति में cascades संकेत की परीक्षा के अलावा, एडिनो – Cre दृष्टिकोण भी vivo में नियोजित किया गया करने के लिए सशर्त प्रयोगात्मक 3,4 जानवरों से जीन निकालने के लिए, और 6 जीव के भीतर कोशिकाओं के विशिष्ट आबादी लेबल. adenovirus प्रणाली भी Cre recombinase के अलावा अन्य मेजबान कोशिकाओं में जीन का परिचय करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस वितरण सदिश का उपयोग करने के दो प्रमुख लाभ अपने उच्च पारगमन और जीन डिलीवरी दक्षता, और मेजबान डीएनए के साथ एकीकरण की कमी कर रहे हैं. हालांकि, उपन्यास रीकॉम्बीनैंट adenoviruses की पीढ़ी श्रम गहन जा सकता है. प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित इसलिए पहले से विकसित एडिनो – Cre वायरस द्वारा शोषण adenoviral प्रणाली की शक्ति harnesses, और युग्मन है कि हमारे हित, Rac1 के floxed एलील के साथ. प्रयोग बाहर इस सशर्त दस्तक के माध्यम से, हम पुष्टि की है कि पारगमन एडिनो – Cre MEFs floxed Rac1 एलील ले जाने के वायरस का उपयोग वास्तव Rac1 के छांटना Rac1 की कमी 2,5 कोशिकाओं के सेलुलर आकारिकी विशेषता में परिवर्तन के लिए अग्रणी के कारण है.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों टोरंटो, ओंटारियो में माउंट सिनाई अस्पताल में प्राथमिक Rac1 / flox flox माउस भ्रूण fibroblasts के अपने उपहार के लिए डॉ. Rizaldy स्कॉट धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के स्वास्थ्य (CIHR, 2009-93526 एमओपी) अनुसंधान और प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC, आरजी 327372-06) कनाडा के न्यू जर्सी के लिए कनाडा के संस्थानों से अनुदान ऑपरेटिंग द्वारा समर्थित किया गया. एसएच और मेगावाट CGSMA और CIHR और NSERC, क्रमशः से तटरक्षक पोत एम पुरस्कार द्वारा समर्थित हैं.
स्टीव Hawley और मेलनी विल्स समान रूप से इस पत्र का योगदान दिया.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Ad-CMV-Cre virus | Vector Biolabs | 1045 | ||
DME High glucose media 500mL | Fisher | SH3002201 | ||
FBS Canadian origin 500mL | VWR | CAA15-701 | ||
PEN-STREP 1X solution 100mL | Fisher | SV30010 | ||
Texas Red-X phalloidin | Invitrogen | T7471 | ||
Trypsin | Sigma | T4549 |