이 비디오에서 우리는 floxed Rac1 allele를 갖고 기본 마우스 배아 섬유아 세포를 감염시킬 Cre 호텔 recombinase 유전자를 갖고 아데노 바이러스를 사용합니다.
유전자 다양한 세포 신호 폭포의 특정 구성 요소를 제거하는 능력은 현대적인 신호 전달 분석에 필수적인 도구가되었습니다. 이 조건 삭제를 달성하기 위해 하나의 특정 방법은 Cre 호텔 – loxP 시스템의 사용을 통해이다. 이 방법은 Cre 호텔의 recombinase 단백질에 대한 구체적인 인식 시퀀스 아르 loxP 사이트와 관심의 유전자를 측면이 포함됩니다. Cre 호텔 – 중재 재조합 loxP 사이트에서 이벤트 및 개입 유전자 3 후속 절단이 효소 결과 소위 floxed (loxP 사이트 둘러싸인) DNA의 노출. 여러 가지 방법은 관심의 사이트에 Cre 호텔 recombinase를 관리할 수 존재합니다. 이 비디오에서는, 우리는 floxed Rac1 allele 1 포함 배아에서 얻은 기본 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 감염하는 Cre 호텔 recombinase 유전자를 포함하는 아데노 바이러스의 사용을 보여줍니다. 우리의 실험 Rac1 MEFs 선택을위한 우리의 근거는 명확 형태학의 변경 사항이 굴지 cytoskeleton 2,5의 변경으로 인해 Rac1의 삭제,시 볼 수 있습니다. 바이러스 전달 및 Cre 호텔 식을 다음과 72시간은 세포가 굴지 염료 phalloidin를 사용하여 스테인드 및 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 몇 군데 있었다. 이것은 adeno – Cre 호텔 바이러스에 노출되었던 MEFs가 감염되지 않은 세포에 비해 이전 보고서 2,5와 일치하는 계약을 체결하고 형태의 길쭉한 나타난 것을 관찰했다. Cre 호텔 recombinase 전달의 아데노 바이러스 방법은 adeno – Cre 호텔 바이러스가 쉽게 사용할 수로 유익하고, 세포의 거의 100 %에 Cre 호텔을 통해 유전자 삭제는 최적화된 adenoviral 감염 얻을 수 있습니다.
함께 비디오는 재조합 바이러스가 Cre 호텔 recombinase를 사용하여 체외에서 소비세 특정 유전자하는 데 사용할 수있는 방법을 exemplifies. 이 프로토콜의 개발은 그러나 번지 가치가 어떤 특정 지점을 밝히지 않았다.
문화 캐스케이즈 신호의 심사 넘어, adeno – Cre 호텔 접근법은 또한 조건 실험 동물 3,4에서 유전자를 제거하고, 유기체 6 안에서 세포의 특정 인구 라벨 생체내에 채용되었습니다. 아데노 바이러스 시스템은 또한 호스트 세포에 Cre 호텔 recombinase 이외의 다른 유전자를 도입하기 위해 적용할 수 있습니다. 이 배달 벡터를 사용하는 두 가지 주요 장점은 높은 전달 및 유전자 전달 효율, 및 호스트 DNA와 통합의 부족입니다. 그러나, 소설 재조합 adenoviruses의 세대 집중적인 노동 수 있습니다. 프로토콜 여기서 설명하는 것은 이전에 개발 adeno – Cre 호텔 바이러스를 이용하여 adenoviral 시스템의 전원을 장비하고, 커플링 관심, Rac1 우리의 floxed allele과 함께. 실험 아웃이 조건부 노크를 통해, 우리는 MEFs가 floxed Rac1의 allele를 들고의 adeno – Cre 호텔 바이러스를 사용하여 전달 실제로 Rac1 – 결함 세포 2,5의 세포 형태 특성의 변화로 이어지는 Rac1의 절단을 일으킬 않는 것으로 확인되었습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 기본 Rac1 flox / flox 마우스 배아 섬유아 세포의 자신의 선물 토론토, 온타리오 마운트시나이 병원에있는 닥터 Rizaldy 스콧 감사하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구 (CIHR, 청소 2009-93526)와 자연 과학 및 캐나다 공학 연구위원회 (NSERC, RG 327372-06)의 캐나다 연구소에서 뉴저지에 보조금을 운영하여 지원했다. SH와 MW는 CGSMA 각각 CIHR과 NSERC에서 CGS – M 보너스에 의해 지원됩니다.
스티브 홀리와 멜라니 윌스 마찬가지로이 문서에 기여.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Ad-CMV-Cre virus | Vector Biolabs | 1045 | ||
DME High glucose media 500mL | Fisher | SH3002201 | ||
FBS Canadian origin 500mL | VWR | CAA15-701 | ||
PEN-STREP 1X solution 100mL | Fisher | SV30010 | ||
Texas Red-X phalloidin | Invitrogen | T7471 | ||
Trypsin | Sigma | T4549 |