Bu video floxed Rac1 allel taşıyan birincil fare embriyonik fibroblastlar bulaştırmak için Cre recombinase gen taşıyan bir adenovirüs kullanın.
Genetik olarak çeşitli hücre sinyalizasyon kaskadlar belirli bileşenleri kaldırmak için modern sinyal iletimi analizi yeteneği ayrılmaz bir araç olmuştur. Cre-loxP sisteminin kullanımı yoluyla bu koşullu silme işlemini gerçekleştirmek için özel bir yöntem. Bu yöntem ile ilgi gen Cre recombinase protein için özel tanıma dizileri loxP siteleri, yan içerir. Sözde floxed (loxP sitesi ile çevrili) DNA Cre-aracılı bir rekombinasyon loxP siteleri olay ve müdahale gen 3 sonraki eksizyonu bu enzim sonuçlarına maruz kalması. Cre recombinase ilgi site yönetmek için birkaç farklı yöntem bulunmaktadır. Bu video, floxed Rac1 allel 1 içeren embriyolar elde edilen birincil fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) bulaştırmak için Cre recombinase gen içeren bir adenovirüs kullanımını göstermektedir. Deneyler için Rac1 MEFS seçimi için gerekçe bu aktin hücre iskeletinin 2,5 değişiklikler nedeniyle Rac1 silinmesi, üzerine belirgin morfolojik değişiklikler görülebilmektedir. Viral iletimi ve Cre ifade takiben 72 saat, hücreleri aktin boya Phalloidin kullanılarak boyandı ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak görüntülü edildi. Adeno-Cre virüsüne maruz kalmış MEFS, enfekte olmamış hücrelere oranla daha önceki raporlarda 2,5 tutarlı sözleşmeli ve morfolojisinde uzatılmış ortaya çıktığını gözlendi. Cre recombinase teslim adenovirüs yöntem adeno-Cre virüs kolaylıkla ulaşılabilir olduğu gibi avantajlı ve hücrelerin yaklaşık% 100 Cre yoluyla gen delesyonu optimize edilmiş adenoviral enfeksiyonu ile elde edilebilir.
İlişikteki video rekombinant virüs Cre recombinase kullanarak in vitro tüketim belirli bir gen nasıl kullanılabileceğini örnek teşkil etmektedir. Ancak bu protokolün geliştirilmesi ele değer bazı belirli noktaları ortaya yaptı.
Kültür kaskadlar sinyalizasyon inceleme ötesinde, adeno-Cre yaklaşımı da, deney hayvanları 3,4 genler koşullu kaldırın ve 6 içinde bir organizmanın hücreleri belirli toplumlarda etiket in vivo olarak istihdam edilmiştir . Konak hücre içine Cre recombinase başka genlerin de tanıtmak için adenovirüs sistemi adapte edilebilir. Bu teslim vektör kullanarak iki temel avantajı, yüksek iletimi ve gen teslim verimliliği ve konak DNA ile entegrasyon eksikliği. Ancak, yeni rekombinant adenovirüs nesil Emek yoğun olabilir. Burada açıklanan protokol bu nedenle daha önce geliştirilen adeno-Cre virüs istismar adenoviral sistemi gücünü sürdürür ve kaplin faiz, Rac1 floxed allel. Bu deney koşullu vuruş sayesinde, MEFS floxed Rac1 allel taşıyan adeno-Cre virüs kullanarak transdüksiyon gerçekten Rac1 eksikliği hücreleri 2,5 hücresel morfoloji karakteristik değişiklikleri önde gelen Rac1 eksizyonu neden olduğunu doğrulamıştır.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, Toronto, Ontario bölgesindeki Mount Sinai Hastanesi Dr. Rizaldy Scott birincil Rac1 Flox / Flox fare embriyonik fibroblastlar onun hediye için teşekkür etmek istiyorum . Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR, 2.009-93.526 MOP) ve Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC 327.372-06 RG) Enstitüleri NJ hibe işletim tarafından desteklenmiştir. SH ve MW CGSMA ve sırasıyla CIHR ve NSERC, KKS-M ödül tarafından desteklenmektedir.
Steve Hawley ve Melanie Wills bu kağıt için aynı derecede katkıda bulunmuştur.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Ad-CMV-Cre virus | Vector Biolabs | 1045 | ||
DME High glucose media 500mL | Fisher | SH3002201 | ||
FBS Canadian origin 500mL | VWR | CAA15-701 | ||
PEN-STREP 1X solution 100mL | Fisher | SV30010 | ||
Texas Red-X phalloidin | Invitrogen | T7471 | ||
Trypsin | Sigma | T4549 |