Summary
Här presenterar vi ett montage protokoll för färgade
Abstract
Flera välkända morfogenetiska gradienter och cellulära rörelser uppstår längs ryggens / ventrala axel
Protocol
1. Imaging Metodik
- Smält glycerin gelé i en 55 ° C grader vattenbad i 20-30 minuter tills det blir en homogen vätska. Swirl, men inte skaka flaskan för att undvika uppkomsten av bubblor.
- Medan gelé smälter, applicera ett tunt skikt av glycerol med en Kimwipe på en ren glasskiva (tillval).
- Pipettera över 1 till 1,5 ml av smält glycerin med gelé ett snitt spets P1000 pipett på ytan på bilden för att skapa en tunn första skiktet. Pipettera noggrant för att undvika bubblor.
- Låt gelé stelna i 5 minuter på en horisontell yta, placera sedan bilden vid -20 ° C i 5 min och gå vidare till embryo justering. Alternativt kan täcka bilden med Saran Wrap och placera den i 4 ° C i upp till 5 dagar.
- Pipettera en liten droppe av målat embryon i 70% glycerol / PBS eller andra antifade glycerol-baserade montering medier (t.ex. Slowfade eller Vectashield) på sidan av gelé sängar.
- Börja redan rikta embryon genom individuellt överföra dem från drop till gelé ytan. Överföra dem med hjälp av ett lutande injektionsnål, med sneda sidan som en sked.
- Ungefär plats embryona längs 2 till 3 kolumner. Om ett embryo fastnar i nålen, rör om i droppen som innehåller andra embryon för att frigöra det. Slösa inte tid noggrant anpassa dem på denna punkt. Lämna lite utrymme mellan kolumnerna.
- Rikta in embryon genom att skjuta dem horisontellt på gelé mediet med hjälp av injektionsnålen. Medan glidande, Orient för krona och klave i samma riktning. Gör dem parallellt med varandra längs kolumnen. Avlägsna överskott av PBS glycerol kvar som ett spår med en bit tvinnad Kimiwipe.
Notera: Överskott glycerol orsakar embryon löst inneslutet inom gelé, vilket resulterar i separation av de två gelé lager, vilket gör det svårt att skära och montera. Omvänt kommer att ta bort för mycket glycerol torra och platta embryon. - Använd ett snitt gul spets för att sprida ett tunt lager av gelé över embryon (50 till 150 mikroliter, beroende på hur många som var anpassade).
- Placera bilden i -20 ° C frys i 10-20 min eller lagra den vid 4 ° C över natten. Se till att gelé är helt stel innan kapning. Annars kommer blocket av embryon vara mycket svårt att punktskatter. Bästa resultat för skärning erhålls på följande dag.
- Enligt en dissekera omfattning, använda ett rakblad för att skära helt igenom gelé på båda sidor av anpassad embryon. Håll rakbladet i 90 ° vinkel för att göra raka snitt. Nedskärningarna ska göras mycket nära främre och bakre stolpar av de embryon som förhindrar alltför stora gelé som kan hindra avbildning.
- Tillsätt 100-200 mikroliter av kall PBT (4 ° C, PBS 0,1% Tween 20) bredvid nedskärningar och försiktigt skrapa bort gelé mellan embryon med hjälp av en spatel.
Obs: diskmedel i PBT hjälper avlägsnande av gelé från bilden utan att skada embryon. - Med hjälp av en nål, överföra block av gelé med inbäddade embryon till en ren bild för vidare bearbetning. Skär mindre block med 5-7 embryon. Använd PBT att enkelt flytta runt i gelé blocket. Alternativt, placera block på en torr glasyta att låta det fäster vid glaset, vilket skapar mer stabilitet för just trimma gelé, om det behövs.
- Vänd upprätt embryona inbäddad i gelé med hjälp av ett rakblad och en nål. För visualisering under mikroskop, gå vidare med något av de två stegen nedan beroende på vilken typ av mikroskop monter som används.
- Inverterat mikroskop: placera färdiga embryot block på en lång täckglas med embryon i upprätt position. Se till att den sida av embryot med minsta mängd gelé kommer i närmare kontakt med målet.
- Upprätt mikroskop: göra två högar med fyra # 1 täckglas limmade med superlim för att användas som "stöder" och placera embryot blocket i glycerol i mellan "stöd". Överbrygga högar med hjälp av en lång täckglas.
- För konfokala analys, kontrollera arbetsavstånd av de mål som ska användas för att ta reda på om du kan bilden hela vägen genom embryot eller endast delvis. Till exempel D. melanogaster embryon har ~ 0,55 mm i längd och kan vara helt avbildas med en Zeiss 20x Plan-Apo eller en 40x LD Neo-Fluor mål. Följande hemsida har information om tillgängliga Zeiss mål och ger dig möjlighet att söka mål i enlighet med arbetsavstånd: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php
2. Representativa resultat
Eftersom embryona finns kvar intakt, kan denna metod användas för att ta exakta mätningar av embryots storlek och avstånd mellan mönster genuttryck. I Figur 1 visar vi ett embryon BLASTODERM skede färgas med den nukleära fläcken DAPI (blå), anti-ryggfenan protein (röd), SOG mRNA (gul) och SNA mRNA (grön). Morfologiska procesSES kan t.ex. invagination av mesoderm (Figur 2A, B) och migration av mesodermal celler (Figur 3 och 4) också visualiseras med denna metod. Olika Z-positioner längs DV-axeln kan erhållas genom att ändra fokalplanet, som visas i figurerna 2-4.
Figur 1. Upprätt optisk skiva av en intakt embryo i BLASTODERM skede. Dubbelklicka färgning av mRNA och protein. Mål mRNA för in situ-sonder (SOG och SNA) och protein färgas av primär antikropp (anti-ryggfenan) indikeras i figuren. DAPI användes för att märka kärnor. Observera att uttrycket av SOG och SNA finns apikalt i cytoplasman, medan uttrycket av ryggfenan är kärnkraft. Starka signaler från SPM begynnande avskrifter som finns i atomkärnor kan också ses på denna förstoring.
Figur 2. Upprätt avbildning av en intakt gastrulating embryo. MRNA prober som används och dessa har olika färger anges i figuren. A) Observera att i detta skede, tre gener färgade med samma Fluor (SNA, SOG och DPP, i grönt), uttrycks i rumsligt åtskilda domäner. Den invaginating mesoderm uttrycker SNA uttrycker neuroblast lagret ind och ektoderm uttrycker DPP, medan SPM Uttrycket förekommer fortfarande i ventrala delar av nervsystemet. B) I en djupare konfokala plan av samma embryo konstaterar vi basen av invaginating mesoderm starkt uttryck för SNA, men dess apikala regionen uttrycker lägre nivåer.
Figur 3. Upprätt avbildning av en intakt embryo med groddar bandet förlängd SPM RNA (gul),. Snigel, ind och mRNA DPP (grön), ryggfenan protein (röd). Kärnor färgades med DAPI (blå). A) fokalplan nära embryo huvudet. B) En annan fokalplanet i bagageluckan regionen samma embryo. Notera massa mesodermal celler innan laterala migration (jämför Figur 4) ligger nära den ventrala mittlinjen på båda sidor av en bakterie-band längre embryo. Formförändras neuroblaster är märkta i grönt (IND och SNA).
Figur 4. Upprätt avbildning av en intakt embryo under groddar bandet förlängning SPM RNA (gul),. Snigel, ind och mRNA DPP (grön), ryggfenan protein (röd). A) Lägg märke till delaminering neuroblaster från epitelet (pilen), färgade både ind och SNA i detta skede (grön). Notera också den begränsade uttryck för SPM att den ventrala mittlinjen (gul). Redovisning av DPP i detta skede kan ses på laterala sidor av embryot (asterisk). B) Optisk avsnitt i samma embryot visas i en nära slutet av embryot längd, vilket motsvarar mitten av posteriora regionen. Den ventrala mittlinjen cellerna färgas för SOG.
Discussion
Med tvärsnitt bilder av Drosophila embryon kan vara en utmaning eftersom det kräver antingen en försiktig hand dissekering av skivor 2 eller användning av inbäddade medier för mikrotom bearbetning, som vanligtvis är skadlig för lysrör stainings. Alternativt kan Z-högar som görs i en konfokalmikroskop användas för att göra 3D-rekonstruktion av tvärsnitt bilder. Men det är tidskrävande att göra flera tunna Confocal skivor för en korrekt 3D-rekonstruktion och fotoblekning blir problematiskt. Ett annat bekymmer när imaging embryon som är monterade långskepps är den ljusspridning som uppstår när man kommer till djupare delar av embryot, vilket också komplicerar ta exakta mätningar av fluorescerande signaler i syfte att kvantifiering av protein eller mRNA-uttryck nivåer 1. Även med en två-photon konfokalmikroskop är ljusspridning fortfarande en oro på grund av opaciteten äggulan material i mitten av embryot, vilket gör valet av montering media för optimal insyn i prov som ska begränsas.
För att kringgå dessa problem, vertikalt en ny teknik som kallas "End-on" avbildning av positionering embryon har nyligen utvecklats för att bilden både live och fasta prover 4. I detta papper har vi utvecklat ett nytt protokoll för vertikalt monterade embryon som möjliggör en enkel bearbetning och visualisering av fasta embryon eller vävnader av valfri storlek och form som är färgade med flera på plats sonder 3. Vår metod består av att använda ett montage medier med gelatinös konsistens som används för att innesluta anpassade embryon i den. Klipp block av denna montering media som innehåller inbäddade embryon kan placeras upprätt innan avbildning i någon typ av konfokalmikroskop.
Genom att bädda in embryon till gelé och placera dem vertikalt, kan vi ta horisontella tvärsnitt med hjälp av konfokalmikroskopi, där cellerna längs ryggens-ventrala axeln på embryot presenteras samtidigt. Detta är en betydande förbättring för kvantifiering ändamål eftersom problem med ljusspridning och fotoblekning av fluorescerande färger som förekommer i konventionella Z-stack rekonstruktion av longitudinellt monterade embryon är nu eliminerats. Således är kvantifiering av genuttryck eller protein nivåer längs ryggens-ventrala axeln korrekt, eftersom cellerna ligger på motsatt dorsal-ventrala positioner avbildas på samma gång och på samma konfokala Z-position. Dessutom kan den beskrivna metoden för oss att skaffa en komplett 2-D bild över rygg-ventrala axel från en 3-D embryo utan att använda komplicerade beräkningsproblem dragits metoder för att visualisera celler vid olika positioner längs DV axel 6.
Några av de kritiska stegen omfattar avlägsnande av glycerol efter justering embryon, för att undvika att dela mellan två lager av gelé. Om provet är för uttorkad, kommer den resulterande bilden vara missbildade och har felaktiga morfologi. Dessutom, om gelé mediet runt embryot är skuren i en vinkel istället för rakt, kan den resulterande bilden visas mindre rund och mer ovular i formen, på grund av en felaktig placering av embryona i en vinkel än 90 grader. Slutligen, om gelé inte kapas nära nog att embryot på främre / bakre ändar, är det inte möjligt att få en korrekt bild, eftersom målet är att arbeta avstånd skulle främst användas för att fokusera i gelé och inte embryot.
Ett annat viktigt steg som kan behövas när imaging sent gastrulating embryot är att noggrant sortera stadierna av intresse omfattas innan anpassa dem. Vanligtvis är embryon iscensatt enligt morfologiska egenskaper som kan vara mest lätt att känna igen när en längsgående position.
Bland alternativa modifieringar som kan göras med denna metod är att inkludera ett anti-fade reagens (t.ex. p-Fenylendiamin eller PPD) i det andra lagret gelé för att skydda mot fotoblekning av fluorescerande färgämnen.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna är speciellt skuld till Deborah Harris och Danielle MacKay. Stöd för detta arbete lämnades av Institutionen för biologi och College of Arts and Sciences i CWRU, och genom HHMI licensnummer 52005866 för stöd till grundutbildning inom de biologiska vetenskaperna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerin Jelly mounting media | Electron Microscopy Sciences | 17998-10 | Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997. |
| Zeiss LSM 700 Confocal | Carl Zeiss, Inc. | The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm). | |
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT) | |||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Glass cover slips | Electron Microscopy Sciences | 72204-02 | Size 1 ½ (specific for the objectives used in this work). |
| Glass cover slips (for making supports) | Fisher Scientific | 12-544-10 | Use four coverslips glued with superglue. |
| Dissection microscope | M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop | M420 | |
| Razor blade | Steel back single edge industrial blades | ||
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Hypodermic needles | Fisher Scientific | 1482610 | 26 Gauge |
| Pipettes | Labnet International |
References
- Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos. Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).
- Grβhans, J., Wieschaus, E. A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila. Cell. 101, 523-531 (2000).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).
- Zander, R. H. On mounting delicate bryophytes in glycerol. The Bryologist. 100, 380-382 (1997).
- Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).
