Summary
여기 스테인드에 대한 마운트 프로토콜을 제시
Abstract
몇 가지 잘 알려진 morphogenetic의 그라디언트 및 세포 움직임의 지느러미 / 복부 축을 따라 발생
Protocol
1. 이미징 방법론
- 그것은 동질적인 액체 될 때까지 20~30분을위한 55 ° C 학위 물 목욕에 젤리 글리세린을 용융. 소용돌이하지만, 거품의 형성을 피하기 위해 병을 흔들지 마세요.
- 젤리가 녹으 동안 깨끗한 유리 슬라이드 (옵션)에 Kimwipe를 사용하여 글리세롤의 얇은 레이어를 적용합니다.
- 녹은 글리세린의 피펫 1-1.5 ML 젤리 얇은 첫번째 레이어를 만들려면 슬라이드의 표면에 상처의 P1000의 피펫 팁을 사용합니다. 거품을 피하기 위해 조심스럽게 피펫.
- 젤리가 수평 표면에 5 분 후, 5 분 -20 ° C에서 슬라이드를 장소와 배아 정렬로 이동합니다 고체화하자. 또는 사란 랩과 슬라이드를 커버하고 최대 5 일 4 ° C에서 그것을 놓으십시오.
- 젤리 침구의 측면에 70 % 글리세롤 / PBS 또는 기타 antifade 글리세롤 기반 설치 미디어 (예 : Slowfade 또는 Vectashield)의 스테인드 배아의 작은 방울 피펫.
- 개별적으로 젤리 표면에있는 드롭에서 그들을 전송하여 배아를 미리 정렬 시작합니다. 숟가락으로 한쪽으로 치우 쳤던 측면을 사용하여 한쪽으로 치우 쳤던 피하 바늘을 사용하여 전송합니다.
- 대략 2-3 열 함께 배아를 놓습니다. 태아가 바늘에 걸리면, 다른 배아 그것을 릴리스가 포함된 드롭에 저어. 신중하게이 시점에서 그들을 정렬 시간을 낭비하지 마십시오. 열 사이에 공간을 둡니다.
- 피하 바늘의 도움으로 젤리 매체에 수평을 슬라이딩하여 배아를 맞춥니다. 동안 슬라이딩, 방향 같은 방향으로 머리와 꼬리. 열에 따라 서로 그들이 평행합니다. 뒤틀린 Kimiwipe의 조각 흔적으로 남아 PBS의 글리세롤의 초과를 제거합니다.
참고 : 초과의 글리세롤이 어려운 잘라 탑재하고, 두 젤리 레이어의 분리의 결과로, 배아는 젤 이내 느슨하게 쌌다도록합니다. 반대로, 너무 글리세롤을 제거하는 건조하고 배아를 평평하게합니다. - 배아 (50-150 μL, 정렬 얼마나 많은에 따라 다름)를 통해 젤리의 얇은 레이어를 확산하기 위해 상처 노란색 팁을 사용하십시오.
- 플레이스 10-20 분 -20 ° C의 냉동고에 슬라이드 또는 4 ° C 야간에 그것을 저장합니다. 젤리가 절단하기 전에 완전히 딱딱한 있는지 확인하십시오. 그렇지 않으면, 배아의 블록 소비세 매우 어려운 것입니다. 절단에 대한 최상의 결과는 그 다음날에 얻을 수 있습니다.
- 해부 현미경, 정렬 태아의 양쪽에있는 젤리를 통해 완전히 잘라 면도날을 사용합니다. 바로 상처를 만들기 위해 90 ° 각도로 면도날을 잡아. 상처는 이미지를 막지 수 있습니다 여분의 젤리를 피하기 위해 태아의 앞쪽에 및 사후 기둥 매우 가까이하여야한다.
- 추운 PBT (4 ° C, PBS 0.1 % 트윈 20) 상처 조심스럽게 주걱을 사용하여 태아 사이의 젤리를 긁어 옆에.의 100-200 μL 추가
참고 : PBT의 세제는 배아를 손상하지 않고 슬라이드에서 젤리의 제거를 도와줍니다. - 바늘을 사용하여 더욱 절단을위한 깨끗한 슬라이드에 포함된 배아와 젤리의 블록을 전송합니다. 5-7 배아와 작은 블록을 잘라. 쉽게 젤리 블록 이동에 PBT를 사용합니다. 또는, 그것이 필요한 경우 정확하게, 젤리를 트리밍에 대한 더 안정성을 만드는 유리에 부착하도록 건조 유리 표면에 블록을 놓으십시오.
- 면도날과 바늘의 도움으로 젤리에 포함된 똑바로 배아를 플립. 현미경 시각화 들어, 사용중인 스탠드 현미경의 종류에 따라 아래의 두 단계 중 하나를 진행합니다.
- 거꾸로 현미경 : 장소가 직립 위치에 태아와, 긴 coverslip에 배아 블록을 완료했다. 젤리의 최소 금액과 함께 배아의 측면이 목적으로 가까이 접촉하는 것임을 확인합니다.
- 입식 현미경 : "지원"으로 사용하고있는 "지원"사이에 글리세롤의 배아 블록을 배치하는 superglue와 붙어 네 # 1 coverslips 두 개의 스택을합니다. 긴 coverslip을 사용하여 스택을 다리.
- 공촛점 분석을 위해, 확인하는 데 사용할 목적의 작업 거리를 확인해 이미지 배아를 통해 모든 방법을하거나 일부만 여부. 예를 들어, D. melanogaster의 배아는 길이 ~ 0.55 mm을 가지고 전적으로 자이스 혈구 20x 계획 - APO 또는 40x LD 네오 플루어 목표를 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. 다음 웹 사이트를 사용할 수 자이스 혈구의 목표에 대한 정보를 가지고 여러분에게 작업 거리에 따라 목표를 검색할 수있는 옵션을 제공합니다 : https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php을
2. 대표 결과
배아가 그대로 유지되기 때문에이 방법은 태아의 크기와 유전자 발현 패턴 사이의 거리의 정확한 측정을하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 1에서, 우리는 핵 얼룩 DAPI (파란색), 안티 도설 단백질 (적색), SOG의 mRNA (노란색)와 SNA의 mRNA (녹색)와 스테인드 배반엽 스테이지 배아를 보여줍니다. 형태학의 procesSES, mesoderm의 invagination (그림 2A, B)와 mesodermal 세포 (그림 3 및 4)의 마이 그 레이션 등도이 방법을 사용하여 시각하실 수 있습니다. DV의 축을 따라 다른 Z - 위치가 같은 그림 2-4과 같이 초점 비행기를 변경하여 얻을 수 있습니다.
그림 1. 배반엽 단계에 손상 배아의 직립 광학 조각. mRNA와 단백질에 대한 이중 염색법. 현장 프로브의 (SOG 및 SNA)과 기본 항체 (안티 도설)의 스테인드 단백질에 대한 대상 mRNAs는 그림 표시됩니다. DAPI는 핵 레이블에 사용되었습니다. 도설의 표현이 핵 동안 SOG와 SNA의 표현이, 세포질에 apically 위치됩니다. 핵에 위치하고 있습니다 SOG 초기 성적에서 강한 신호도이 확대에서 볼 수 있습니다.
그림 2. 손상 gastrulating 배아의 직립 영상. mRNA 프로브는 사용하고 각각의 색상은 그림 표시됩니다. A)이 단계에서, 세 유전자 같은 플루어 (녹색 SNA, SOG 및 dpp)와 스테인드합니다이 공간 분리 도메인에서 표현됩니다. invaginating mesoderm은 SNA를 표현, neuroblast 계층이 산업을 표현하고 SOG의 표현은 여전히 신경 시스템의 복부 지역에있는 동안 ectoderm은 dpp를 표현합니다. B) 같은 배아의 깊이 공촛점 비행기, 우리는 강하게 SNA을 표현 invaginating mesoderm의 기반을 참고하지만, 그 꼭대기의 지역은 낮은 수준을 표현하고 있습니다.
그림 3. . 달팽이, 산업 및 dpp의 mRNAs (녹색), 도설 단백질 (빨간색), 세균 밴드와 손상 배아의 입식 영상은 SOG RNA (노란색)을 확장. 핵은 DAPI (파란색)와 스테인드되었습니다. 배아의 머리 근처) 초점 비행기. 같은 배아의 트렁크 지역에서 B) 또 다른 초점 비행기. 세균 밴드 확장 배아의 양쪽에 가까운 복부 정중선 거짓말하는 측면 마이 그 레이션하기 전에 mesodermal 세포 (4 그림과 비교할 때)의 참고 질량. Delaminating neuroblasts는 녹색 (산업 및 SNA)에 표시됩니다.
그림 4. 세균 대역 확장하는 동안 손상 배아의 입식 이미징 SOG RNA (노란색). 달팽이, 산업 및 dpp의 mRNAs (녹색), 도설 단백질 (빨간색). A), 상피 (화살표)에서 delaminating neuroblasts 참고이 단계 (녹색)에서 산업 및 SNA에 대해 모두 스테인드. SOG의 제한된 표현은 배면의 정중선 (노란색) 또한 있습니다. 이 단계에서 dpp 표현은 배아 (별표)의 측면 양쪽에서 볼 수 있습니다. B) 같은 배아의 광학 섹션 중순 후부 지역에 해당하는 배아 길이의 끝 부분에 표시됩니다. 복부 정중선 세포가 SOG를 위해 얼룩이 있습니다.
Discussion
그것이 조각 2 보통 형광 stainings에 대한 해로운 것입니다 마이크로톰 처리, 임베디드 미디어의 사용 중주의 손 절개를 필요로하기 때문에 Drosophila의 배아의 단면 이미지를 촬영하는 것은 도전하실 수 있습니다. 또는 공촛점 현미경에서 만든 Z - 스택은 단면 이미지의 3D 재건을하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 정확한 3D 재건과 photobleaching problematical되어 여러 얇게 공촛점 조각 만들기 위해 소모 시점입니다. 길이 방향 탑재되어 영상 태아도 단백질 또는 mRNA 표현 수준 1 부량의 목적을 위해 형광 신호의 정확한 측정을 복용 복잡 배아의 깊은 부분에 도달하면 발생하는 광 산란 또 다른 관심사. 심지어 두 광자 공촛점 현미경으로 빛이 산란은 여전히 제한 샘플 최적의 투명성에 대한 설치 매체의 선택을 만드는 배아의 중간에 노른자 소재의 불투명도에 의한 관심사입니다.
이러한 문제를 회피하려면, 위치 배아의 "최종의"이미지라는 새로운 기술은 수직으로 최근 4 살 및 고정 샘플 모두 이미지로 개발되었습니다. 본 논문에서는, 우리는 현장 프로브 3 여러 물들일되는 크기와 모양의 고정 배아 또는 조직의 간단한 준비 및 시각화를 허용 수직으로 장착 태아를위한 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 우리의 방법은 그 안에서 정렬 배아를 싸는 데 사용되는 젤라틴 일관성있는 장착 미디어를 사용하여 구성됩니다. 임베디드 배아를 포함하는이 장착 미디어 컷 블록은 공촛점 현미경의 어떤 유형의 이미징 전에 직립 위치 수 있습니다.
젤리에 배아를 포함하고 수직으로 그들을 위치함으로써, 우리는 배아의 지느러미 - 복부 축을 따라 세포가 동시에 제공되는 공촛점 현미경을 사용하여 수평 교차 섹션을 수 있습니다. 이것은 빛을 산란과 길이 방향 탑재 배아들 중 기존의 Z - 스택 재건에서 발생하는 형광 염료의 photobleaching 지금 제거 아르의 문제 때문에 부량을 위해 상당한 개선이다. 반대 지느러미 - 복부 위치에있는 세포가 동시에 같은 공촛점 Z - 위치에서 몇 군데 있기 때문에 따라서, 지느러미 - 복부 축을 따라 유전자 발현 또는 단백질 수준의 부량은 정확합니다. 또한, 설명 방법은 우리가 DV 축 6 따라 다른 위치에 세포를 시각화하기 위해 복잡한 계산 unrolling 방법을 사용하지 않고 3 - D 배아에서 지느러미 - 복부 축에 걸쳐 완벽한 2 - D 이미지를 얻을 수 있습니다.
중요한 단계 중 일부는 젤리의 두 레이어 사이의 분할 피하기 위해, 배아를 정렬 후 여분의 글리세롤을 제거 있습니다. 그러나, 샘플도 탈수있다면, 그 결과 이미지가 결함이하고 잘못된 형태가됩니다. 배아 주변 젤리 매체가 아니라 바로 이상의 각도로자를 경우뿐만 아니라, 결과 이미지는 90도 이외의 각도로 배아의 잘못된 위치로 인해, 모양의 적은 둥근 더 ovular 나타날 수 있습니다. 젤리가 앞쪽에 / 사후 끝에 배아와 밀접하게 충분한 절단되지 않는 경우 마지막으로, 그것은 목표의 작동 거리가 주로 젤리 아니라 배아에 초점을 사용하는 것입니다 때문에 적절한 이미지를 얻을 수 없습니다.
영상 후반 gastrulating 배아는 신중하게 정렬하기 전에 범위에 따라 관심의 단계를 정렬할 때 필요할 수 있습니다 또 다른 중요한 단계. 보통 태아는 세로 위치에서 가장 쉽게 인식된다 형태학의 특성에 따라 개최됩니다.
이 방법으로 만들 수 대체 수정 중에서 형광 염료의 photobleaching으로부터 보호하기 위해 젤리의 두 번째 계층에 방지 퇴색 시약 (예 : P - Phenylenediamine 또는 PPD) 포함하는 것입니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자 데보라 해리스와 다니엘 맥케이 특히 빚을 수 있습니다. 이 작품에 대한 지원이 생물학과 CWRU의 예술과 과학의 대학의학과에서 제공하고, 생물 학적 과학의 학부 교육에 대한 지원 HHMI 부여 번호 52005866로.했습니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerin Jelly mounting media | Electron Microscopy Sciences | 17998-10 | Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997. |
| Zeiss LSM 700 Confocal | Carl Zeiss, Inc. | The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm). | |
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT) | |||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Glass cover slips | Electron Microscopy Sciences | 72204-02 | Size 1 ½ (specific for the objectives used in this work). |
| Glass cover slips (for making supports) | Fisher Scientific | 12-544-10 | Use four coverslips glued with superglue. |
| Dissection microscope | M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop | M420 | |
| Razor blade | Steel back single edge industrial blades | ||
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Hypodermic needles | Fisher Scientific | 1482610 | 26 Gauge |
| Pipettes | Labnet International |
References
- Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos. Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).
- Grβhans, J., Wieschaus, E. A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila. Cell. 101, 523-531 (2000).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).
- Zander, R. H. On mounting delicate bryophytes in glycerol. The Bryologist. 100, 380-382 (1997).
- Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).
