Summary
यह आलेख वर्णन प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं biomechanical और mechanobiological अध्ययन के लिए चूहे की पूंछ tendons तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया. तैयारी में मुख्य कदम के कई सुविधाओं, निष्कर्षण, पार के अनुभागीय क्षेत्र माप के साथ शुरुआत, rinsing और bioreactor कक्ष में लोड करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं.
Abstract
चूहा पूंछ tendons (RTTs) एक आम जैविक कण्डरा फिजियोलॉजी और tendinopathy के क्षेत्रों में इन विट्रो अध्ययन में प्रयोगात्मक में इस्तेमाल मॉडल हैं. उन ऊतकों के साथ कार्य करना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि वे बहुत नाजुक हैं, और अब तक उनके अलगाव के लिए कोई कठोर विस्तृत प्रोटोकॉल था.
इन चुनौतियों से सामना है, हम तरीकों और उपकरणों RTTs और नियंत्रण ऊतक व्यवहार्यता बाँझपन और अखंडता के हेरफेर की सुविधा विकसित किया है. यह आलेख वर्णन प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं biomechanical और mechanobiological अध्ययन के लिए RTTs तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया. निष्कर्षण, पार के अनुभागीय क्षेत्र माप, rinsing और bioreactor कक्ष में लोड: हमारा काम चार मुख्य चरणों में विभाजित है.
हर कदम पर, सभी प्रक्रियाओं, सामग्री, और चतुराई में विस्तार से प्रस्तुत कर रहे हैं इतना है कि वे आसानी से reproduced किया जा सकता है है. इसके अलावा, विशिष्ट विकसित उपकरणों प्रस्तुत कर रहे हैं: एक हेरफेर थाली RTTs अलग करने के लिए इस्तेमाल किया, एक ऑप्टिक पार के अनुभागीय क्षेत्र माप और एक प्रस्तोता प्रणाली के दौरान ऊतक स्थिति सुक्ष्ममापी एक bioreactor पर RTTs संलग्न करने के लिए.
अंत में, हम कई परीक्षणों के बाद हमारे तरीके को मान्य करने के लिए प्राप्त परिणामों का वर्णन. व्यवहार्यता बाँझपन, और अखंडता मूल्यांकन दिखाना है कि हमारे प्रक्रियाओं चूहे की पूंछ, tendons जैसे नाजुक ऊतकों की जोड़तोड़ के लिए पर्याप्त कठोर हैं.
Protocol
किसी भी हेरफेर करने के लिए पहले, आप प्रयोग आप का आयोजन कर रहे हैं और अपने स्वभाव में तंत्र पर निर्भर करता है के लिए इस्तेमाल किया जा tendons के समूह की पहचान करना चाहिए. हमारे प्रयोजनों के लिए, उदर, tendons, क्योंकि वे छोटे हैं चुने गए और इस तरह आसान हेरफेर करने के लिए जब पार के अनुभागीय क्षेत्र को मापने और उन्हें bioreactor कक्ष में फिटिंग.
कृपया कृपया ध्यान दें कि सभी उपकरणों autoclaved हैं या 70% इथेनॉल के साथ निष्फल. इसके अलावा, एक स्प्रे बोतल 70% इथेनॉल युक्त प्रत्येक काम स्टेशन के बगल में रखा जाता है प्रत्येक ऑपरेशन से पहले प्रयोगकर्ताओं दस्ताने बाँझ.
भाग 1: निकालना
लकीर के बाद, पूंछ ध्यान से अपने extremities द्वारा चालाकी है के ऊतकों को नुकसान पहुँचाए से बचने. इसके अलावा, सेल व्यवहार्यता के संरक्षण के लिए, सभी जोड़तोड़ बाहर ठंड नमकीन घोल में किया जाता है.
1 ए) सामग्री:
- शीत नमकीन घोल (डी पीबीएस)
- कुचल बर्फ
- भूतल रक्षक
- बोर्ड काटना
- व्यक्तिगत हेरफेर प्लेटें
- 2 500 मिलीलीटर व्यंजन
- 2 2L कांच व्यंजन
- चिपकने वाला टेप
- एक चिमटी
- 1 संदंश
- एक चिमटी खड़े
- शल्य कैंची की एक जोड़ी
- एक स्केल्पल
- शल्य कैंची की एक जोड़ी
चित्रा 1 उन्मुखीकरण पहचान के साथ व्यक्तिगत हेरफेर ("प्रॉक्सिमल" के लिए "पी") .
) 1B कार्य स्टेशन:
- सतह रक्षक बाहर बिखरा हुआ है और काटने बोर्ड के शीर्ष पर जगह है.
- आधे रास्ते करने के लिए प्रत्येक दो बड़े गिलास व्यंजन कुचल बर्फ के साथ भरें और कागज पर उन्हें जगह.
- हेरफेर की थाली के एक कोने पर टेप का एक टुकड़ा छड़ी और एक पत्र के साथ की पहचान करने के लिए प्रॉक्सिमल अंत का संकेत है.
- ठंड नमकीन घोल के साथ दो आधे रास्ते करने के लिए छोटे कांच के बर्तन और हेरफेर प्लेटों के सभी grooves भरें. उन्हें बड़े गिलास बर्फ युक्त बर्तन में रखें.
- सतह रक्षक पर सभी बाँझ उपकरणों को व्यवस्थित करें.
- एक नमकीन घोल युक्त गिलास पकवान की में पूंछ स्थानांतरण.
1C) जोड़तोड़:
- पूंछ के प्रॉक्सिमल अंत में शरीर रचना विज्ञान निरीक्षण पृष्ठीय तरफ से उदर पक्ष भेद. उदर पक्ष tendons की एक बड़ी संख्या है और एक रक्त वाहिका है कि धीरे पूंछ निचोड़ करने के लिए रक्त के छोटे बूंदों का उत्पादन द्वारा सत्यापित किया जा सकता है.
- शल्य कैंची का प्रयोग, पूंछ के पृष्ठीय पक्ष के साथ त्वचा की कटौती यदि आप उदर, tendons (या ventral पक्ष अगर आप पृष्ठीय tendons की जरूरत के साथ) निकालने के लिए चाहते हैं.
- प्रॉक्सिमल अंत में चीरा खोलें और ध्यान से पूंछ समाप्त होता है जोड़ तोड़ द्वारा संदंश या अपनी उंगलियों और का उपयोग कर त्वचा को हटा दें.
- रक्त और नमकीन घोल में बाल कुल्ला और शेष गिलास ताजा समाधान युक्त पकवान में नमूना हस्तांतरण. दस्ताने बदलें.
एक आड़ा प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत मुख्य देखी गयी मुख्य अनुभाग छह कण्डरा समूहों से पता चलता है. प्रत्येक समूह से एक पट्टा प्रत्येक कशेरुका का दुम अंत से जुड़ी है, इसलिए हम intervertebral डिस्क में कटौती के लिए कटौती के साथ नए tendons बेनकाब.
चित्रा 2 चूहे प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत देखी गयी पूंछ के आड़ा अनुभाग . - शल्य कैंची के साथ उपास्थि 2-3 छोटे कशेरुकाओं के माध्यम से बाहर का अंत कट. काटने बोर्ड पर पूंछ प्लेस एक स्केलपेल और तो तुरंत समाधान में जगह का उपयोग कर नरम ऊतकों में कटौती.
- चिमटी का प्रयोग, बाहर का पूंछ अंत से बाहर एक पट्टा खींच.
- दोनों सिरों पर एक सज्जन पकड़ के साथ, व्यक्तिगत हेरफेर थाली में पट्टा जगह है.
पिछले दो चरणों को दोहराएँ जब तक कोई और अधिक tendons छेड़ा जा सकता है और एक कशेरुका कम कटौती जब भी नए ऊतकों को उजागर करने की आवश्यकता है.
भाग 2: क्रॉस अनुभागीय क्षेत्र माप 7
जब ऊतक यांत्रिक लक्षण वर्णन या उत्तेजना आए, इसके यांत्रिक गुणों कण्डरा अंदर तनाव को बल सामान्य से वर्णित हैं. यही कारण है कि हम पार के अनुभागीय क्षेत्र का मूल्यांकन.
) 2A सामग्री:
- ऑप्टिक माइक्रोमीटर
- Stereomicroscope
- डिजिटल कैमरा
- एज मान्यता और प्रोफाइल पुनर्निर्माण एल्गोरिदम 5,6
- शीत नमकीन घोल (डी पीबीएस)
- 1 20 200μL माइक्रो मात्रा विंदुक
- 1 ऑप्टिक सुक्ष्ममापी समायोजन के लिए हेक्स कुंजी
- 2 चिमटी
/ "Alt =" files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg 3 / चित्रा ">
चित्रा 3 ऑप्टिक माइक्रोमीटर.
2B) कार्य स्टेशन:
- सॉफ्टवेयर (डिजिटल कैमरा और एल्गोरिदम) खोलें.
- ऑप्टिक सुक्ष्ममापी इतनी जगह है कि तंत्र में पट्टा लोड करने के लिए पर्याप्त कमरा है.
- उपकरणों और गिलास पकवान युक्त निकाले हाथ में करीब tendons व्यवस्थित करें.
2C) जोड़तोड़:
- ठंड नमकीन घोल के साथ मापने डिब्बे भरें जब तक दोनों लंगर प्रणाली जलमग्न हैं.
- डिब्बे में चिमटी के साथ समाप्त होता है धारण करके कण्डरा स्थानांतरण.
- सूक्ष्म मात्रा विंदुक के माध्यम से चूषण का उपयोग करना, एक समय में सिलिकॉन ट्यूब में एक सिरा खींच. Aspirate के अंत तक शाफ्ट कॉलर से परे फैली हुई है.
- शाफ्ट कॉलर कस करने के लिए ट्यूब सेक और stereomicroscope तहत तंत्र स्थापित है.
- 105X बढ़ाई, tendons खिंचाव है जबकि ऊतक देख जब तक creases नहीं रह रहे हैं प्रत्यक्ष. अतिरिक्त 0.40% द्वारा खींचो.
चित्रा 4 पहले 105x बढ़ाई और खींच के बाद कण्डरा प्रक्षेपण . - स्थिति को समायोजित और एक 180 ° रोटेशन पर एक पट्टा का एक स्पष्ट छवि को बनाए रखने के लिए ध्यान केंद्रित.
- तनाव ध्यान देते हैं, या स्थिति को संशोधित करने के बिना हर 10 ° रोटेशन पर एक तस्वीर ले लो. रोटेशन के लिए बाहर ले केवल रोटरी शाफ्ट का प्रयोग करें. इसके शंकु आकार के कारण, इन चरणों का पट्टा के साथ विभिन्न बिंदुओं पर दोहराया जा सकता है.
- बढ़त मान्यता और प्रोफ़ाइल पुनर्निर्माण एल्गोरिदम सक्रिय क्रम में डेटाबेस पंजीकृत किया है विश्लेषण.
- कण्डरा शाफ्ट कॉलर ढीला और सिलिकॉन सूक्ष्म मात्रा पिपेट का उपयोग कर ट्यूब में हवा में उड़ा द्वारा मुफ्त.
- हेरफेर की थाली पर पट्टा Reinsert, फिर इसे समाप्त होता है के द्वारा संभाल.
- प्रोफ़ाइल प्राप्त पुनर्निर्माण और पार के अनुभागीय क्षेत्र के मूल्य के आकार को सत्यापित करें.
भाग 3: Rinsing
संदूषण है कि पिछले जोड़तोड़ के दौरान हुई हो सकती है है निकालने के ऊतकों जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत rinsed हैं.
) 3A सामग्री:
- शीत नमकीन घोल (डी पीबीएस)
- एकाधिक नाली हेरफेर प्लेट
- व्यक्तिगत हेरफेर प्लेटें
- चिपकने वाला टेप
- 2 चिमटी
- एक चिमटी खड़े
) 3B कार्य स्टेशन:
- अग्रिम में जैव सुरक्षा कैबिनेट 15 मिनट में प्रशंसक पर मुड़ें और 70% इथेनॉल के साथ अंदर सतहों को साफ.
- जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर सभी उपकरणों लाओ.
- प्रत्येक व्यक्ति की थाली के एक कोने पर टेप के टुकड़े छड़ी प्रॉक्सिमल अंत की पहचान.
- बाँझ नमकीन घोल के साथ सभी grooves के भरें.
3C) जोड़तोड़:
- कैबिनेट में निकाले कण्डरा युक्त हेरफेर थाली का परिचय.
- चिमटी का प्रयोग, प्रत्येक के अंत पर एक सज्जन समझ के साथ अपनी थाली से कण्डरा हटायें.
- विसर्जित कर दिया और धीरे से कई नाली हेरफेर प्लेट के प्रत्येक डिब्बे के नमकीन घोल में कण्डरा हलचल, निकटतम से शुरू और दूर नाली के लिए आगे बढ़ने से.
- अंत में, एक व्यक्ति हेरफेर की थाली में कण्डरा डूब.
भाग 4: bioreactor कक्ष में लोड हो रहा है
आगे संक्रमण से बचने के लिए, निम्न जोड़तोड़ भी जैव सुरक्षा कैबिनेट में आयोजित की जाती हैं.
) 4A सामग्री:
- Bioreactor 4 कक्ष
- बाँझ एंकर
- 1 बाँझ पेट्री डिश
- शीत सेल सुसंस्कृत मध्यम (DMEM)
- Cyanoacrylate
- 2 चिमटी
- चिमटी खड़े
- 0.5 10μl माइक्रो मात्रा विंदुक
- एक शासक
चित्रा 5 bioreactor कक्ष.
4B) कार्य स्टेशन:
- चूंकि पिछले चरण भी जैव सुरक्षा, कैबिनेट, में महसूस किया गया था अनावश्यक उपकरणों को हटाने के तुम और अधिक काम करने की जगह दे देंगे.
- कैबिनेट के अंदर अन्य सभी उपकरणों लाओ.
) 4C जोड़तोड़:
- हेरफेर की थाली पर अपने स्पूल कण्डरा छोर पर केंद्रित है और ऊतकों को घाव अप के साथ और स्पूल के आसपास एक लंगर रखें.
- लंगर रोल पर और ढीला सिरा पकड़ जबकि यह सुनिश्चित करना है कि ऊतक लंगर के लिए संलग्न रहता है. ¾ बाद बारी बंद करो.
- बाहर ही कैर्रीदूसरे छोर के साथ कदम.
- समान रूप से दोनों एंकर का रोल जब तक वहाँ उनके 1 केंद्रों के बीच 6 सेमी है .
- कण्डरा ढीला करने के लिए यह समाधान में विसर्जित और लंगर वर्गों संक्षिप्त शुष्क करने के लिए अपने यांत्रिक 2-3 गुणों को बढ़ाने की अनुमति .
- पेट्री डिश में cyanoacrylate डालो और सूक्ष्म मात्रा पिपेट में 2.5μL आकर्षित.
- नमकीन घोल में किसी भी गोंद छोड़ने के बिना cyanoacrylate के एक ऊतक घाव - अप करने के लिए ड्रॉप लागू करें. दोहराएँ जब तक 2 बूँदें प्रत्येक लंगर के लिए लागू किया गया है.
- साथ कण्डरा अभी भी पूरी तरह से डूबे, गोंद के लिए 5 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए पूरी तरह से सूखे.
- इस समय के दौरान, नमकीन घोल के साथ चैम्बर डिब्बे भरें.
- नुकसान को रोकने के लिए खारा समाधान के साथ सभी ऊतक rehydrate.
- केवल एंकर से छेड़छाड़ करके, bioreactor चेंबर में पट्टा हस्तांतरण और इसे बंद करने के लिए और स्थानांतरण के दौरान रिसाव प्रदूषण को रोकने के.
भाग 5: प्रतिनिधि परिणाम:
प्रोटोकॉल के परिणाम से पता चलता है कि जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, हमारी कठोर ऊतक अलगाव और तैयार करने की प्रक्रिया ऊतक बाँझपन, व्यवहार्यता और अखंडता को बनाए रखने के लिए संभव बनाते हैं.
सबसे पहले, सरल और दोहराव निष्कर्षण विधि का उपयोग, हम कोलेजन नेटवर्क हानिकारक के रूप में यह एच एंड ई दागी निष्कर्षण के बाद एहसास वर्गों के एक सूक्ष्म विश्लेषण के द्वारा देखा जा सकता है है बिना पूंछ tendons निकालने में सक्षम हैं.
चित्रा 6 निष्कर्षण के बाद कण्डरा कोलेजन नेटवर्क (5μm अनुदैर्ध्य एच एंड ई के साथ दाग अनुभाग) .
हम दस दिन और आयोजित बाँझपन परीक्षण के लिए तो सुसंस्कृत, tendons. हर दिन, हम चढ़ाया अगर पर इस्तेमाल संस्कृति समाधान और यह 24 घंटे के लिए incubated. कोई बैक्टीरियल वृद्धि के बाद से मनाया गया, हम ने निष्कर्ष निकाला है कि हमारे जोड़तोड़ संदूषण में परिणाम नहीं है.
प्रोफ़ाइल पुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म और ऑप्टिक सुक्ष्ममापी के साथ, हम 7 त्रुटि के एक मार्जिन 2% के भीतर पार के अनुभागीय क्षेत्र का अनुमान करने में सक्षम हैं.
7 चित्रा एक RTT की प्रोफाइल पुनर्निर्माण.
अंत में, हम स्तनधारी कोशिकाओं के लिए rinsing के कदम के बाद और एक संस्कृति बारह दिन की अवधि के बाद / LIVE मृत किट / cytotoxicity व्यवहार्यता का उपयोग कर व्यवहार्यता का मूल्यांकन. हरी फ्लोरोसेंट जीवित कोशिकाओं के एक बड़े बहुमत के बाद से स्पष्ट किया गया है, हम पुष्टि कर सकते हैं कि हमारे अलगाव प्रक्रियाओं रहते ऊतक के संरक्षण में सफल रहे हैं. ही परीक्षण bioreactor चेंबर में पट्टा संलग्न करने के बाद दो घंटे प्रदर्शन किया था. हम सत्यापित कि निर्जलीकरण और लंगर पर गोंद दोनों लंगर के बीच ऊतकों में फैल गया था.
8 चित्रा लंगर में ऊतक व्यवहार्यता (हरी = जीवित कोशिकाओं, लाल = मृत कोशिकाओं)
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Discussion
उन प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को लागू करके, हम ऊतकों के इस तरह पर इन विट्रो अध्ययन में की एक विस्तृत विविधता का संचालन कर सकते हैं. उदाहरण के लिए के रूप में, ऊतक अध: पतन पर एक अध्ययन के तहत उत्तेजना के दस दिनों की अवधि के लिए RTTs करने के लिए आवेदन के द्वारा किया गया. हर दिन, हम गैर विनाशकारी तनाव छूट परीक्षणों में ऊतकों के यांत्रिक गुणों का मूल्यांकन. अंत में, हम RTT तनाव परिवर्तन का निरीक्षण और इस तरह यांत्रिक गुणों की प्रगति का विश्लेषण करने में सक्षम थे.
9 चित्रा भिन्नता है RTT तनाव मूल्यांकन गर्त विश्राम परीक्षण (1 से 10 दिन).
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह लेख # NSERC 299,280 अनुदान, IRSST द्वारा एक स्नातक छात्र अनुसंधान एम. Cyr पुरस्कार के रूप में जी जनक और FRSQ के लिए एक छात्रवृत्ति के रूप में समर्थित किया गया था. हम वीडियो पर दर्ज की जोड़तोड़ प्रदर्शन करने के लिए Lemieux - Laneville Yoan धन्यवाद.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-PBS | Reagent | Wisent Inc. | 311-410-CL | Saline solution |
| Glucose | Reagent | Wisent Inc. | 609-037-EL | Saline solution 1g/L |
| Antibiotics-antimycotics | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | Saline solution 1% |
| DMEM | Reagent | Invitrogen | 12800-017 | Culture solution |
| Sodium Bicarbonate | Reagent | Wisent Inc. | 600-105-CG | Culture solution 3.7g/L |
| FBS | Reagent | Wisent Inc. | 090150 | Culture solution 10% |
| Antibiotics-antimycotics | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | Culture solution 1% |
| Optic Micrometer | Tool | Custom Made | ||
| Manipulation plate | Tool | Custom Made | ||
| Bioreactor chamber | Tool | Custom Made |
References
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