Summary
Bu makalede, biyomekanik ve mechanobiological çalışmalar için sıçan kuyruğu tendonları hazırlamak için kullanılan deneysel prosedürleri açıklamaktadır. Biyoreaktör odasına durulama ve yükleme, çıkarma, kesit alanı ölçümü ile başlayan hazırlık olarak önemli adımlar çeşitli özellikleri göstermiştir.
Abstract
Sıçan kuyruk tendon (RTTs) tendon fizyolojisi ve tendinopathy alanlarında in vitro çalışmalarda deneysel olarak kullanılan ortak bir biyolojik model. Bu dokuları ile çalışmak çok kırılgan olduğu için, zor ve şimdiye kadar kendi izolasyonu için herhangi bir titizlikle ayrıntılı bir protokol vardı.
Bu zorlukları ile karşı karşıya kalan, biz RTTs manipülasyon ve kontrol doku canlılığı, kısırlık ve bütünlüğünü kolaylaştırmak için yöntemler ve araçlar geliştirdik. Bu makale, biyomekanik ve mechanobiological çalışmalar için RTTs hazırlamak için kullanılan deneysel prosedürleri açıklamaktadır. Ekstraksiyon, kesit alanı ölçümü, durulama ve biyoreaktör odasına yükleme: Çalışmalarımız dört ana adımları ayrılır.
Her adımda, kolaylıkla çoğaltılabilir böylece tüm prosedürleri, malzeme ve manipülasyon detaylı olarak sunulmaktadır. Ayrıca, geliştirilen özel araçların sunulmuştur: RTTs ayırmak için kullanılan bir manipülasyon plaka, kesit alanı ölçüm ve ankraj sistemi sırasında doku konumlandırmak için bir optik mikrometre RTTs biyoreaktör üzerine takmak için.
Son olarak, biz yöntemleri doğrulamak için birden fazla testlerinden sonra elde edilen sonuçlar açıklanmaktadır. Canlılığı, kısırlık ve bütünlüğünü değerlendirmeler prosedürleri gibi sıçan kuyruğu tendonları gibi hassas dokuların manipülasyonlar için yeterince titiz olduğunu göstermektedir.
Protocol
Önceden herhangi bir manipülasyon, tendonların grup yapıyorlar deney ve cihazı kendi eğilim bağlı olarak kullanılmak üzere tanımlamanız gerekir. Bizim amaçlarımız için, ventral tendonları kesit alanı ölçüm ve biyoreaktör odasına takarken işlemek için böylece daha kolay çünkü daha küçük seçilen ve.
Tüm aletler otoklava veya% 70 etanol ile sterilize olduğunu lütfen unutmayınız. Ayrıca,% 70 etanol içeren bir sprey şişesine her operasyon öncesi deneyciler eldiven sterilize etmek için her iş istasyonunun yanında yer alır.
Bölüm 1: Ekstraksiyon
Rezeksiyonu sonra, kuyruk dokulara zarar vermemek için dikkatle ekstremitelerde tarafından manipüle. Ayrıca, hücre canlılığını korumak için, tüm manipülasyonlar, soğuk tuzlu su solüsyonu içinde yapılır.
1A) Malzemeler:
- Soğuk salin solüsyonu (D-PBS)
- Ezilmiş buz
- Yüzey koruyucu
- Kesim tahta
- Bireysel manipülasyon plakaları
- 2 500 ml yemekleri
- 2 2L cam yemekleri
- Yapışkan bant
- 1 Cımbız
- 1 Forseps
- 1 Cımbız standı
- 1 Çift cerrahi makası
- 1 Neşter
- 1 Çift cerrahi makas
Şekil 1 yönelim kimlik ile bireysel manipülasyon ("proksimal" için "P")
1B) İş istasyonu:
- Yüzey koruyucusu yaymak ve kesme tahtası üstüne yerleştirin.
- , Kırılmış buz ile yarıya her iki büyük cam yemekleri doldurun ve kağıt üzerine koyun.
- Manipülasyon plaka bir köşesine bir parça bant Stick ve proksimal sonunu belirtmek için bir harf ile tanımlamak.
- Soğuk serum fizyolojik ile yarım ile iki küçük cam tabaklar ve manipülasyon plakaları tüm oluklar doldurun. Buz içeren geniş cam yemekleri yerleştirin.
- Yüzey koruyucusu tüm steril aletleri düzenleyin.
- Tuzlu solüsyon içeren cam tabak içine bir kuyruk aktarın.
1C) İşlemler:
- Dorsal tarafında ventral tarafı ayırt etmek için kuyruk proksimal sonunda anatomisi dikkat edin. Ventral tarafı tendonların daha çok sayıda ve küçük bir damla kan üretmek için kuyruk hafifçe sıkarak kontrol edilebilir bir kan damarı vardır.
- Ventral tendon (veya dorsal tendonları gerekiyorsa ventral kenarı boyunca) ayıklamak istiyorsanız, cerrahi makas kullanarak, kuyruk dorsal kenarı boyunca deri kesme.
- Proksimal sonunda kesi açın ve dikkatli bir şekilde kuyruk uçları manipüle ederek, forseps veya parmaklarınızı kullanarak cilt kaldırmak.
- Salin solüsyonu kan ve saç durulayın ve taze solüsyon içeren kalan cam tabak içine örnek aktarmak. Eldivenleri değiştirin.
Işık mikroskobu altında incelendi çapraz bölümünde altı tendon grupları gösterir. Her grup bir tendon Her omur kuyruk sonuna kadar bağlı, bu yüzden kesim boyunca yeni tendonları maruz intervertebral disk kesilir.
Şekil 2 Enine bölümüne ışık mikroskobu altında incelendi sıçan kuyruğu. - Cerrahi makas ile kısa kıkırdak 2-3 vertebra ile distal ucu kesin. Kuyruk, neşter ve hemen ardından çözüm yerine kullanarak yumuşak dokuları kesmek için kesme tahtası üzerine yerleştirin.
- Cımbız kullanarak, tek bir tendon distal kuyruk ucundan çekin.
- Her iki ucunda yumuşak bir tutuş, bireysel manipülasyon plaka tendon yerleştirin.
Daha fazla tendon dışarı alay kadar son iki adımı tekrarlayın ve yeni dokuların maruz gerektiğinde bir omur kısa kesmek.
Bölüm 2: kesit alanı ölçüm 7
Doku mekanik karakterizasyonu veya stimülasyon uğrar, mekanik özellikleri tendon içinde stres kuvvet normalleştirilmesi tarafından açıklanmıştır. Bu kesit alanı değerlendirmek nedeni budur.
2A) Malzemeler:
- Optik Mikrometre
- Stereomikroskopta
- Dijital fotoğraf makinesi
- Kenar tanıma ve bilgileri yeniden yapılanma algoritmaları 5,6
- Soğuk salin solüsyonu (D-PBS)
- 1 20-200μL Micro hacmi pipet
- Optik mikrometre ayarlamalar için 1 Hex anahtarı
- 2 Cımbız
/ Files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg "alt =" Şekil 3 "/>
Şekil 3 Optik Mikrometre
2B) İş istasyonu:
- Yazılım (Dijital kamera ve algoritmalar) açın.
- Cihazın tendon yüklemek için yeterli bir oda var, böylece optik mikrometre yerleştirin.
- Araçların ve elinizin altında çıkarılan tendonları içeren cam tabak düzenleyin.
2C) İşlemler:
- Her iki bağlantı sistemleri batık kadar soğuk tuzlu su çözeltisi ile ölçüm bölmesi doldurun.
- Cımbız ile biter tutarak bölmeye tendon transferi.
- Hacimli mikro-pipet ile emme kullanarak, bir defada bir silikon tüp içine ekstremite çekin. Aspire, sonuna mil yaka ötesine uzanan kadar.
- Tüpler sıkıştırmak ve stereomicroscope altında cihazın yüklemek için mil yaka sıkın.
- 105x büyütme kırışıklıklar artık algılanamadığı kadar doku gözlemlerken, tendonları germek. Ek% 0,40 gerin.
Şekil 4 105x büyütme önce ve sonra gerdirme Tendon projeksiyon. - Konumunu ayarlayın ve 180 ° döndürme üzerinde tendon net bir görüntü sağlamak için odak.
- Gerginlik, odak veya pozisyon değiştirmeden 10 ° her devirde bir fotoğraf çekin. Sadece döner mil dönme yürütmek için kullanın. Konik şekli nedeniyle, bu adımlar, tendon boyunca farklı noktalarda tekrar edilebilir.
- Kayıtlı olan veritabanı analiz etmek için kenar tanıma ve profil rekonstrüksiyon algoritmaları etkinleştirin.
- Mil yaka gevşemesine ve mikro hacimli pipet kullanarak silikon tüpler içine hava üfleme tendon Bedava.
- Tendon uçları yeniden işleme, manipülasyon plaka üzerine yeniden takın.
- Elde edilen profil yeniden yapılanma ve kesit alanı değeri şekli olun.
Bölüm 3: Durulama
Önceki manipülasyonlar sırasında meydana gelmiş olabilir kirlenme kaldırmak için, dokuların biyogüvenlik kabini altında durulanır.
3A) Malzemeler:
- Soğuk salin solüsyonu (D-PBS)
- Çoklu-groove manipülasyon plaka
- Bireysel Manipülasyon plakaları
- Yapışkan bant
- 2 Cımbız
- 1 Cımbız standı
3B) İş istasyonu:
- Önceden Biyogüvenlik kabini 15 dakika içinde fan açın ve% 70 etanol ile iç yüzeylerini temizlemek.
- Biyogüvenlik kabini içindeki tüm enstrümanları getirin.
- Proksimal sonuna belirlemek için, her bir plaka bir köşesine üzerine bant parçaları sopa.
- Steril serum fizyolojik ile bütün oluklar doldurun.
3C) İşlemler:
- Ayıklanan kabinede tendon içeren manipülasyon plaka tanıtın.
- Cımbız kullanarak, her iki ucunda hafif bir kavrayışa sahip, plaka tendon çıkarın.
- Bırakın ve yavaşça en yakın ve en uzak oluk geçmeden, çoklu oluk manipülasyon plaka her bölmesi salin solüsyonu tendon karıştırın.
- Son olarak, bireysel bir manipülasyon plakasını tendon daldırın.
Bölüm 4: biyoreaktör odasına Yükleniyor
Daha fazla kontaminasyonu önlemek için, aşağıdaki manipülasyonlar da biyogüvenlik kabini yapılmaktadır.
4A) Malzemeler:
- Biyoreaktör odasının 4
- Steril çapa
- 1 Steril Petri kabı
- Soğuk hücre kültürlerinde Orta (DMEM)
- Siyanoakrilat
- 2 Cımbız
- Cımbız standı
- 0.5-10μl Mikro hacimli pipet
- 1 Cetvel
Şekil 5 Biyoreaktör kamara
4B) İş istasyonu:
- Bir önceki adımda da biyogüvenlik kabini, gerçekleştirilen bu yana gereksiz araçları kaldırılması daha fazla çalışma alanı verecektir.
- Kabin içindeki tüm diğer araçlar getirin.
4C) İşlemler:
- Tendon ekstremite üzerinden merkezli ve doku yara, biriktirme ve makara çevresinde manipülasyon plaka üzerinde bir çapa yerleştirin.
- Çapa Rulo ve doku çapa bağlı kalmasını sağlarken gevşek ekstremite tutun. Sonra ¾ dönüş durdurun.
- Aynı yürütmekdiğer ucunu adımlar.
- Kendi merkezlerinde 1 ila 6 cm kadar üzerinde hem çapa eşit döndürün.
- Çözüm batırın ve bağlantılı bölümler, mekanik özelliklerini 2-3 geliştirmek için kısa bir süre kurumasını bekleyin tendon gevşetin.
- Petri kabı içine siyanoakrilat dökün ve mikro ses pipet içine 2.5μL çizin.
- Salin solüsyonu herhangi bir tutkal düşürmeden yara dokusu siyanoakrilat bir damla uygulayın. 2 damla her çapa kadar bu işlemi tekrarlayın.
- Tendon hala tamamen dalmış, tamamen kurumasını tutkal için 5 dakika bekleyin.
- Bu süre zarfında, tuzlu su çözeltisi ile oda bölmesi doldurun.
- Tüm doku hasarı önlemek için serum fizyolojik ile rehidrate.
- Biyoreaktör odasına sadece çapaların manipüle ederek, tendon transferi ve aktarım sırasında sızıntı ve kirlenmeyi önlemek için yakın.
Bölüm 5: Temsilcilik Sonuçları:
Protokol sonucu doğru yapıldığında, doku sıkı izolasyon ve hazırlık prosedürü doku kısırlık, canlılığı ve bütünlüğünü korumak için mümkün kılan gösterir.
İlk olarak, basit ve tekrarlayan ekstraksiyon yöntemi kullanılarak ekstraksiyonu sonrası gerçekleştirilen H & E kusurludur bölümden mikroskobik analizi ile görülebilir kollajen ağı zarar vermeden kuyruk tendon ayıklamak mümkün.
Şekil 6 ekstraksiyonu sonrası tendon kollajen ağı (H & E ile boyanmış 5μm uzunlamasına kesit).
Daha sonra kültür tendonları on gün yapılan sterilite testleri. Her gün, agar kaplama kullanılan kültür çözeltisi ve 24 saat süreyle inkübe. Herhangi bir bakteri üremesi gözlendi yana, bizim manipülasyonlar bulaşmaya sebep olmadığı sonucuna varmıştır.
Profil rekonstrüksiyon algoritması ve optik mikrometre, biz hata 7% 2 marj içinde kesit alanı tahmin etmek mümkün.
Şekil 7, bir RTT Profil rekonstrüksiyon .
Son olarak, memeli hücreleri için durulama adım sonra, on iki günlük kültür süre sonra DEAD / CANLI Canlılık / Sitotoksisite Kit kullanarak canlılığı değerlendirildi. Yeşil flüoresan canlı hücreler büyük bir çoğunluğu belli olduğundan, izolasyon prosedürleri canlı doku koruyarak başarılı olduğunu teyit edebiliriz. Aynı test biyoreaktör odasına tendon taktıktan sonra iki saat yapıldı. Biz, çapa dehidratasyon ve yapıştırıcı her iki demir arasındaki doku yayılmış olduğu doğrulandı.
Şekil 8 çapa Doku canlılığı (yeşil = canlı hücreleri, kırmızı = ölü hücreleri)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu deneysel yöntemler uygulanarak, biz bu tür dokuların geniş bir yelpazede in vitro çalışmalar yapabilirler. Örneğin, doku dejenerasyonu üzerine bir çalışma, on günlük bir süre için RTTs altında stimülasyon uygulama tarafından gerçekleştirildi. Her gün, tahribatsız stres gevşeme testleri doku mekanik özellikleri değerlendirildi. Sonunda, biz RTT stres değişimi gözlemlemek ve böylece mekanik özellikleri ilerlemesini analiz etmek mümkün.
Şekil 9 RTT Kullanıcı stres değişimi değerlendirilir çukur rahatlama testi (Günde 1 ila 10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu makalede, M. Cyr bir lisans öğrencisi araştırma ödülü olarak G. Ebeveyn ve FRSQ için burslu olarak NSERC Hibe # 299.280, IRSST tarafından desteklenmiştir. Yoan Lemieux-Laneville video kaydedildi manipülasyonlar yapmak için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-PBS | Reagent | Wisent Inc. | 311-410-CL | Saline solution |
| Glucose | Reagent | Wisent Inc. | 609-037-EL | Saline solution 1g/L |
| Antibiotics-antimycotics | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | Saline solution 1% |
| DMEM | Reagent | Invitrogen | 12800-017 | Culture solution |
| Sodium Bicarbonate | Reagent | Wisent Inc. | 600-105-CG | Culture solution 3.7g/L |
| FBS | Reagent | Wisent Inc. | 090150 | Culture solution 10% |
| Antibiotics-antimycotics | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | Culture solution 1% |
| Optic Micrometer | Tool | Custom Made | ||
| Manipulation plate | Tool | Custom Made | ||
| Bioreactor chamber | Tool | Custom Made |
References
- Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. Mechanical properties of various mammalian tendons. J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).
- Dupuis, D. Déshydratation de matrices collagéniques reconstruites in vitro: effets sur les propriétés mécaniques et histologiques [dissertation]. , Québec, Université Laval. Québec. 114-114 (1981).
- Haut, R. C. Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).
- Huppé, N., Lessard, J. -L., Langelier, E. A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).
- Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &, Rancourt, D. Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements. J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).
- Lee, T. Q., Woo, S. L. -Y. A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues. J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).
- Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &, Langelier, E. Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).
