Summary
이 문서 biomechanical 및 mechanobiological 연구 쥐의 꼬리 힘줄을 준비하는 데 사용되는 실험 절차를 설명합니다. 준비의 주요 단계 몇 가지 기능은 rinsing 및 생물 반응기 챔버로 로딩, 추출, 단면적 측정으로 시작, 시연하고 있습니다.
Abstract
쥐 꼬리 힘줄 (RTTs)은 힘줄 생리학과 tendinopathy의 분야에서 체외 연구에서 실험에 사용되는 일반적인 생물 학적 모델입니다. 그 조직과 함께 일하는 것은 그들이 매우 연약하기 때문에 도전하고, 지금까지 자신의 격리에 대한 엄격한 세부 프로토콜이 없었다합니다.
이러한 도전에 직면하여, 우리는 RTTs 및 제어 조직 생존, 불임과 정직의 조작을 용이하게하는 방법과 악기를 개발했습니다. 이 문서 biomechanical 및 mechanobiological 연구 RTTs를 준비하는 데 사용되는 실험 절차를 설명합니다. 추출, 단면적 측정이 rinsing 및 생물 반응기 챔버로 로딩 : 우리 작품은 네 가지 주요 단계로 나뉘어져 있습니다.
그들이 쉽게 복제 수 있도록 각 단계에서 모든 절차, 자료 및 조작이 상세하게 제공됩니다. 또한 개발, 특정 악기 소개하는 부분이있다 : RTTs를 분리하는 데 사용되는 조작 판은 단면적 측정 및 고정 시스템 동안 조직을 위치 광학 마이크로 미터는 생물 반응기에 RTTs를 첨부합니다.
마지막으로, 우리는 방법의 유효성을 검사하기 위해 여러 검사 후 얻은 결과를 설명합니다. 생존, 불임 및 무결성 평가는 우리와 같은 절차가 쥐의 꼬리 힘줄과 같은 연약한 조직의 조작에 대해 충분히 엄격한 것을 보여줍니다.
Protocol
전에 어떤 조작에, 당신이 실시하는 실험을하고 처분의기구에 따라 사용되는 힘줄의 그룹을 식별해야합니다. 우리의 목적을 위해, 복부 힘줄은 단면적을 측정하여 생물 반응기 챔버에 그들을 맞는 경우 조작하기 때문에 쉽게 그들이 작은되기 때문에 선정되었다.
모든 악기가 autoclaved 또는 70 % 에탄올로 소독되는주의하시기 바랍니다. 또한, 70 % 에탄올을 포함하는 스프레이 병은 각 작업 전에 경험 장갑을 소독하기 위해 각 작업 역 옆에 배치됩니다.
1 부 : 추출
절제술 후, 꼬리는 신중하게 조직 손상을 방지하기 위해 사지에 의해 조작할 수 있습니다. 또한, 세포 생존을 보존하기 위해 모든 조작은 차가운 생리 식염수에 실시하고 있습니다.
1A) 자료 :
- 차가운 생리 식염수 (D - PBS)
- 얼음 조각
- 표면 보호
- 보드를 절단
- 개별 조작 플레이트
- 2 500 ML 요리
- 이 2L 유리 요리
- 접착제 테이프
- 1 족집게
- 1 포셉
- 1 족집게는 서
- 외과 가위 1 쌍
- 1 메스
- 외과 가위 1 쌍
그림 1. 오리 엔테이션 식별 개별 조작 ( "근위"를 "P")
1B) 워크 스테이션 :
- 표면 보호를 펴고 위에 도마를 놓습니다.
- 얼음 조각과 함께 중간 각이 큰 유리 접시를 입력하고 종이에 그들을 놓으십시오.
- 조작 판의 모서리에 테이프 조각을 막대기와 근위 끝을 나타내는 문자로 식별합니다.
- 차가운 생리 식염수와 함께 중간에 두 개의 작은 유리 요리와 조작 판의 홈을 입력합니다. 얼음이 들어있는 대형 유리 접시에 놓으십시오.
- 표면 보호의 모든 멸균 악기를 구성합니다.
- 생리 식염수가 들어있는 유리 접시 중 하나에 꼬리를 전송합니다.
1C) 노는 :
- 등의 측면에서 복부 측면을 구별하는 꼬리의 근위 끝에 해부학을 준수. 복부 측면은 힘줄의 큰 번호와 부드럽게 혈액의 작은 방울을 생산하기 위해 꼬리를 당기고하여 확인할 수 혈관 있습니다.
- 당신이 복부 힘줄을 (또는 지느러미 힘줄이 필요하면 복부 쪽 함께) 추출하려는 경우 수술 가위를 사용하여 꼬리 지느러미의 측면을 따라 피부를 잘라.
- 근위 끝에 절개를 열고 조심스럽게 꼬리 끝부분을 조작하여 포셉 또는 손가락을 사용하여 피부를 제거합니다.
- 생리 식염수에 혈액과 머리를 씻어 신선한 솔루션을 포함하는 나머지 유리 접시에 시료를 전송합니다. 장갑을 변경합니다.
가벼운 현미경 아래에서 볼 횡단하는 섹션은 여섯 힘줄이 그룹을 보여줍니다. 각 그룹에서 하나의 힘줄은 각 척추골의 꼬리 끝에 연결된, 그래서 우리는자를 따라 새로운 힘줄을 폭로하기 위해 척추 디스크에 상처입니다.
그림 2. 가벼운 현미경 아래에서 볼 쥐의 꼬리 횡단하는 섹션을 참조하십시오. - 수술 가위로 짧게 연골 2-3 척추를 통해 말초 끝부분을 잘라 버릴거야. 메스 후 즉시 솔루션에 대체를 사용하여 부드러운 조직을 잘라 도마에 꼬리를 놓습니다.
- 족집게를 사용하여 말초 꼬리 끝에서 하나 힘줄이 밖으로 당기십시오.
- 양쪽 끝에 부드러운하라, 개별 조작 판에 힘줄이 장소.
더 이상의 힘줄이 밖으로 조롱 수 없습니다 때까지 마지막 두 단계를 반복하고 새로운 조직이 노출해야 할 때마다 한 번 척추뼈 짧은 컷.
2 부 : 단면적 측정 7
조직이 기계적 특성이나 자극을 겪습 때, 그 기계적 성질은 스트레스에 힘줄 내부의 힘을 정규화에 의해 설명되어 있습니다. 이것은 우리가 단면적을 평가하는 이유입니다.
2A) 자료 :
- 광학 미크롬터
- Stereomicroscope
- 디지털 카메라
- 가장자리 인식 및 프로필 재건 알고리즘 5,6
- 차가운 생리 식염수 (D - PBS)
- 1 20 - 200μL 마이크로 볼륨 피펫
- 광 마이크로 미터 조정 1 헥스 키
- 이 족집게
/ files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg "고도 ="그림 3 "/>
그림 3. 옵틱 미크롬터
2B) 워크 스테이션 :
- 소프트웨어 (디지털 카메라 및 알고리즘)을 엽니다.
- 장치에있는 힘줄이 로드할 충분한 공간이 있도록 광학 마이크로 미터를 놓습니다.
- 악기와 손 가까이에 압축을 푼 힘줄을 포함하는 유리 그릇을 구성합니다.
2C) 노는 :
- 두 앵커 시스템이 변할 때까지 차가운 생리 식염수로 측정 구획을 입력합니다.
- 족집게로 끝을 잡고하여 짐칸에 힘줄이 전송합니다.
- 마이크로 피펫을 통해 볼륨 흡입을 사용하여 실리콘 튜브로 한 번에 하나의 끝단을 가져옵니다. 끝이 축 체포 초과하기 전까지 대기음.
- 튜브를 압축하고 stereomicroscope 아래에있는기구를 설치하는 샤프트 체포를 조이십시오.
- 주름이 더 이상 지각할 수 없을 때까지 조직을 관찰하면서 105X 확대에 힘줄을 스트레칭. 추가 0.40 %의 스트레치.
그림 4. 전에 105x 확대하고 스트레칭 후 텐든 프로젝션. - 위치를 조정하고 180 ° 회전 위에 힘줄의 깨끗한 이미지를 유지하는 데 중점을 둡니다.
- 긴장, 초점이나 위치를 수정하지 않고 모든 10 ° 회전에서 사진을 가져가라. 회전을 수행에만 로터리 축을를 사용합니다. 의 콘 모양으로 인해, 다음 단계는 힘줄 따라 서로 다른 지점에서 반복될 수 있습니다.
- 당신은 등록한 데이터베이스를 분석하기 위해 가장자리의 인식 및 프로필 재건 알고리즘을 활성화합니다.
- 축 체포 느슨해진 및 마이크로 볼륨 피펫을 사용하여 실리콘 튜브에 공기를 불어로 힘줄이 무료입니다.
- 다시 종료하여 처리, 조작 판에 힘줄이 다시 삽입.
- 얻은 프로필 재건과 단면적의 가치의 모양을 확인합니다.
파트 3 : Rinsing
이전 조작 중 발생했을 수 오염을 제거하려면, 조직은 biosafety 캐비닛 아래에 씻어서 있습니다.
3A) 자료 :
- 차가운 생리 식염수 (D - PBS)
- 여러 홈 조작 플레이트
- 개별 조작 플레이트
- 접착제 테이프
- 이 족집게
- 1 족집게는 서
3B) 워크 스테이션 :
- 사전에 biosafety 캐비닛 15 분 팬의 전원을 켜고 70 %의 에탄올과 내부 표면을 청소하십시오.
- biosafety 캐비닛 내부의 모든 악기를 가져와.
- 근위 끝을 확인하기 위해 각 플레이트의 모서리에 테이프의 조각 스틱.
- 멸균 생리 식염수와 함께 홈을 입력합니다.
3C) 노는 :
- 캐비닛에서 추출한 힘줄이있는 조작 판을 소개합니다.
- 족집게를 사용하여, 각 엔드에 부드러운 이해와의 판에서 힘줄을 제거하십시오.
- 젖어도하고 부드럽게 가장 가까운부터 그리고 멀리 홈으로 진행, 여러 홈 조작 판의 각 구역의 생리 식염수에 힘줄이 저어.
- 마지막으로, 잠수함 개별 조작 판에있는 힘줄.
4 부 : 생물 반응기 챔버로 로딩
추가 오염을 피하기 위해 다음과 같은 조작도 biosafety 캐비닛에 실시하고 있습니다.
4A) 자료 :
- 생물 반응기 챔버 4
- 무균 앵커
- 1 무균 배양 접시
- 콜드 세포 교양 중간 (DMEM)
- Cyanoacrylate
- 이 족집게
- 핀셋은 서
- 0.5 - 10μl 마이크로 피펫 볼륨
- 1 눈금자
그림 5. 생물 반응기 챔버
4B) 워크 스테이션 :
- 이전 단계도 biosafety 캐비닛에 실현 이래 불필요한 도구 제거는 더 많은 작업 공간을 제공할 것입니다.
- 캐비닛 안에 다른 모든 악기를 가져와.
4C) 노는 :
- 힘줄 말단을 통해 중심과 조직을 상처의 스풀과 스풀 주위 조작 판에 닻을 놓으십시오.
- 닻을 구르고 조직이 앵커에 연결된 숙박 있도록 동안 느슨한 말단 들어요. 이후 어 회전 중지합니다.
- 같은 수행다른 쪽 끝을과 단계를 반복합니다.
- 그들의 센터 1 사이의 6cm가있을 때까지 동등 이상의 두 앵커를 롤.
- 솔루션에 젖어하고 고정 섹션의 기계적 성질 2-3 향상을 간략하게 건조 수 있도록 힘줄이 느슨하게.
- 페트리 접시에 붓고 cyanoacrylate 및 마이크로 피펫으로 볼륨 2.5μL를 그립니다.
- 생리 식염수에 접착제를 포기하지 않고 상처 접속 조직 cyanoacrylate의 드롭을 적용합니다. 이 방울은 각 앵커에 적용 때까지 반복합니다.
- 힘줄이 아직 완전히 포장되어로 완전히 건조 접착제 5 분 동안 기다리십시오.
- 이 기간 동안 생리 식염수와 챔버 구획을 작성하십시오.
- 손상을 방지하기 위해 생리 식염수 모든 조직을 Rehydrate.
- 단지 앵커를 조작함으로써, 생물 반응기 챔버에 힘줄이 전송 및 전송 중에 누출 및 오염을 방지하기 위해 그것을 닫습니다.
제 5 부 : 대표 결과 :
프로토콜의 결과가 제대로 수행되면, 우리의 조직 엄격한 격리와 준비 절차는 조직 불임, 생존과 무결성을 유지하는 것이 가능하게 보여준다.
먼저, 간단하고 반복적인 추출 방법을 사용하여, 우리는 그것이 추출 후 깨달은 H & E 오염된 부분의 미세한 분석하여 관찰 할 수있는 콜라겐 네트워크를 손상하지 않고 꼬리 힘줄을 추출할 수 있습니다.
그림 6. 추출 후 텐든 콜라겐 네트워크 (H & E 물들일 5μm 세로 섹션).
십 일 실시 불임 검사 위해 우리는 다음 교양 힘줄. 매일 우리 한천에 도금 사용 문화 솔루션과 24 시간 동안 그것을 incubated. 어떤 박테리아 성장이 관찰되지 이래, 우리는 우리 노는 오염 발생하지 않는 결론을 내렸다.
프로필 재건 알고리즘과 광 마이크로 미터로, 우리는 오류 7 2 %의 마진 내에서 단면적을 계산하실 수 있습니다.
그림 7. RTT의 프로필 재건.
마지막으로, 우리는 rinsing 단계 이후 12 일 문화 기간 이후 포유류의 세포에 대한 죽은 / LIVE 생존 / 세포 독성 키트를 사용하여 가능성을 평가. 녹색 형광 라이브 세포의 대다수가 분명하고 있기 때문에, 우리는 격리 절차는 살아있는 조직을 보존 성공적으로되었는지 확인할 수 있습니다. 동일한 시험은 생물 반응기 챔버에 힘줄이 부착 후 두 시간 수행되었다. 우리는 앵커의 탈수와 접착제가 모두 앵커 사이의 조직에 전염되지했다고 확인했습니다.
그림 8. 앵커에서 조직 생존 (녹색 = 라이브 세포, 빨강 = 죽은 세포)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이러한 실험 절차를 적용하여, 우리는 조직의 종류에 체외 연구에서 다양한 수행할 수 있습니다. 예를 들어 마찬가지로, 조직 변성에 대한 연구는 십일 동안 RTTs에 밑을 자극의 응용 프로그램에 의해 실시되었다. 매일, 우리는 비파괴 응력 완화 시험에서 조직 기계적 특성을 평가했다. 끝에, 우리는 RTT 스트레스 변화를 관찰하기 때문에 기계적 성질의 진행을 분석할 수 있었다.
그림 9. RTT의 응력 변화 평가 트러프 휴식 테스트 (매일 1-10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 문서는 M. 씨흐에 학부 학생 연구 보너스로 G.의 부모와 FRSQ하는 장학금으로 NSERC 부여 # 299280, IRSST에 의해 지원되었다. 우리는 비디오 기록 조작을 수행하기위한 Yoan 르뮤 - Laneville 감사합니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-PBS | Reagent | Wisent Inc. | 311-410-CL | Saline solution |
| Glucose | Reagent | Wisent Inc. | 609-037-EL | Saline solution 1g/L |
| Antibiotics-antimycotics | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | Saline solution 1% |
| DMEM | Reagent | Invitrogen | 12800-017 | Culture solution |
| Sodium Bicarbonate | Reagent | Wisent Inc. | 600-105-CG | Culture solution 3.7g/L |
| FBS | Reagent | Wisent Inc. | 090150 | Culture solution 10% |
| Antibiotics-antimycotics | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | Culture solution 1% |
| Optic Micrometer | Tool | Custom Made | ||
| Manipulation plate | Tool | Custom Made | ||
| Bioreactor chamber | Tool | Custom Made |
References
- Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. Mechanical properties of various mammalian tendons. J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).
- Dupuis, D. Déshydratation de matrices collagéniques reconstruites in vitro: effets sur les propriétés mécaniques et histologiques [dissertation]. , Québec, Université Laval. Québec. 114-114 (1981).
- Haut, R. C. Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).
- Huppé, N., Lessard, J. -L., Langelier, E. A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).
- Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &, Rancourt, D. Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements. J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).
- Lee, T. Q., Woo, S. L. -Y. A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues. J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).
- Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &, Langelier, E. Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).
