Vi har utvecklat en enkel och reproducerbar-protokollet för att få tillgång stomatakonduktans svar på levande bakterier. Denna metod minimerar såra och manipulation av bladet jämfört med användningen av epidermala peeling tidigare rapporterats.
Klyvöppningar är naturliga i anläggningen från öppningar epidermis svarar för gasutbyte mellan växt interiör och miljö. De bildas av ett par vakt celler, som kan stänga stomatakonduktans pore som svar på ett antal externa faktorer, inklusive ljusstyrka, koldioxid koncentration och relativ fuktighet (RH). Den stomatakonduktans por är också den viktigaste vägen för patogenen inträde i blad, ett avgörande steg för sjukdomsutvecklingen. Nyligen genomförda studier har avslöjat att stängningen av por är effektivt för att minimera bakteriell sjukdom utveckling i Arabidopsis växter, en del av anläggningen medfödd immunitet. Tidigare har vi använt epidermal peeling för att bedöma stomatakonduktans svar på levande bakterier (Melotto et al 2006.), Men att upprätthålla gynnsamma miljöförhållanden för både växt epidermal peeling och bakterieceller har varit utmanande. Leaf epidermis kan hållas vid liv och friska med MES buffert (10 mM KCl, 25 mm MES-KOH, pH 6,15) för elektrofysiologiska experiment vakt celler. Detta är dock bufferten inte är lämpligt för att erhålla bakteriesuspension. Å andra sidan kan bakterieceller hållas vid liv i vatten som inte är korrekt att upprätthålla epidermal peeling för lång tid. När en epidermal skal flyter på vatten, de celler i skal som utsätts för lufttorka inom 4 timmar begränsa tidpunkten för att genomföra experimentet. En idealisk metod för att bedöma effekten av en viss stimulans på sin vakt celler bör presentera minimala störningar för stomatakonduktans fysiologi och den naturliga miljön av anläggningen så mycket som möjligt. Vi därför utvecklat en ny metod för att bedöma stomatakonduktans svar på levande bakterier i vilka blad såra och manipulation är mycket minimeras syftar till att ge ett enkelt reproducerbar och pålitlig stomatakonduktans analys. Protokollet är baserat på färgning av intakta blad med propidiumjodid (PI), inkubation av färgning blad med bakteriesuspension, och observation av löv i laserskanning konfokalmikroskop. Slutligen ger denna metod för observation av samma bor bladet prov under lång tid med hjälp av villkor som nära efterliknar de naturliga förhållanden under vilka växter angrips av patogener.
Vi har presenterat en rättfram procedur för att mäta stomatakonduktans bländare i intakta bladvävnad möjliggör en enkel bedömning av stomatakonduktans svar på olika behandlingar.
Även om vi har presenterat resultat med hjälp av Arabidopsis modellsystem / Pseudomonas syringae kan intakt blad stomatakonduktans analys vara potentiellt utföras med någon växt-bakterie kombination. Protokollet kan lätt modifieras för att passa tillväxt kraven i andra växter och bakterier. Den övergripande principen och förfarandet förblir desamma. Dessutom kan denna metod vara till nytta för forskare som vill studera funktionell effekt på vakt celler inte bara att leva mikrober, men även till andra stimuli och kemiska under förhållanden som behåller bladen naturliga miljö.
Hela blad kan vara svåra att bilden på grund av dess tjocklek och ojämn topografi. Detta problem kan lindras genom att ta bort mitten ven av bladet så att den ligger plant på bilden och använder konfokalmikroskopi. Däremot kan andra typer av fluorescensmikroskop användas för att få högupplösta bilder av bladet ytan.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av ett bidrag från National Institute of Health och The University of Texas i Arlington inrättat medel till MM.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | ||
Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-1 | ||
Yeast Extract | Difco | 0127-01-7 | ||
Sodium Chloride | VWR | 7647-14-5 | ||
Agar | Bio Express | J637-2500G | ||
Plant growth chamber | ||||
Shaker incubator | ||||
Laser scanning confocal microscope |