Provning Protozoacidal aktivitet Ligand-lytisk Peptider Mot Termite Protozoa Gut In vitro (Protozoa Kultur) och In vivo (Mikroinjektion i Termite hindgut)

Summary

Vi presenterar förfaranden för att påvisa att ligander binder till ytan membranet i protozoer cellulosa-smälta protozoer i tarmen av Formosan underjordiska termiter med fluorescerande mikroskopi och att ligander tillsammans med lytisk peptider dödar dessa

Abstract

Vi utvecklar en ny metod för att underjordiska termit kontroll som skulle leda till minskat beroende av användningen av kemiska bekämpningsmedel. Underjordiska termiter är beroende av protozoer i hindguts arbetstagare att effektivt smälta trä. Lytisk peptider har visat att döda en mängd encelliga djur parasiter (Mutwiri et al. 2000) och även protozoer i tarmen av Formosan underjordiska termit, Coptotermes formosanus (Husseneder och Collier 2009). Lytisk peptider är en del av ospecifika immunförsvaret hos eukaryoter, och förstöra membran av mikroorganismer (Leuschner och Hans 2004). De flesta lytisk peptider sannolikt inte kommer att skada högre eukaryoter, eftersom de inte påverkar den elektriskt neutrala kolesterol-innehållande cellmembran högre eukaryoter (Javadpour et al. 1996). Lytisk peptid åtgärder kan riktas till specifika celltyper genom tillsats av en ligand. Till exempel, rapporterade Hansel et al. (2007) att lytisk peptider konjugerat med membran cancer cell receptor ligander kan användas för att förstöra cellerna bröstcancer, medan lytisk peptider ensam eller konjugerat med icke-specifika peptider inte var effektiva. Lytisk peptider har också konjugerad till mänskliga hormoner som binder till receptorer på tumörceller för riktade förstörelse av prostata-och testikelcancer cancerceller (Leuschner och Hans 2004).

I denna artikel presenterar vi tekniker som används för att demonstrera protozoacidal aktiviteten hos en lytisk peptid (Hecate) kopplad till en heptapeptid ligand som binder till ytan membranet för protozoer från tarmen av Formosan underjordiska termit. Dessa tekniker innefattar utrotande av tarmen från termit arbetare, anaerob kultur tarmen protozoer (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni,
Spirotrichonympha leidyi), mikroskopiska bekräftelse på att liganden märkt med en fluorescerande färg binder till termit tarmen protozoer och andra viltlevande protozoer men inte bakterier eller tarmen vävnad. Vi visar också att samma liganden kopplad till en lytisk peptid effektivt dödar termit tarmen protozoer in vitro (protozoer kultur) och in vivo (mikroinjektion i hindgut för arbetstagare), men är mindre bacteriacidal än lytisk peptid ensam. Förlusten av protozoer leder till döden av termiter på mindre än två veckor.

I framtiden kommer vi ingenjör genetiskt mikroorganismer som kan överleva i termiter hindgut och sprids via en termit koloni som "trojanska hästar" för att uttrycka ligand-lytisk peptider som skulle döda protozoer i termiter tarmen och därefter döda termiter i kolonin . Ligand-lytisk peptider även vara användbar för utveckling av läkemedel mot protozo parasiter.

Protocol

Experiment 1: Utvinning av termit tarmen protozoer under anaeroba förhållanden

1. Använd en fläkt låda (Coy Laboratories) i en handskfacket att ständigt cirkulera luft genom ett torkmedel och typ D katalysator Stak-Paks att styra luftfuktighet och syrehalt och eliminera ojämna temperaturer. Fyll i handskfacket med en kontinuerlig ström av kväve i 20 till 30 min. Övervaka syrenivåer med en syresensor (C-kvadrat, Inc.), 1 h. Använd kväve för att nå och upprätthålla anaeroba förhållanden när det behövs.
2. Förbered Trager U media (Trager 1934) och justera pH till 7,0. Sparge filtret steriliseras media i handskfacket med en blandning av 2,5% väte, 5% koldioxid och 92,5% kväve för 1 h för att ta bort syre rester.
3. Silaniseras allt material, inklusive objektglas, rör mikrocentrifug, pipetter, glas mm som används i experiment med Sigmacote att förhindra adsorption av protozoer eller peptider till ytor (Sigmacote, Sigma, # SL-2, http://www.sigmaaldrich.com/ etc / mediaLib / docs / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf).
4. Sedan termit tarmen protozoer är strikt anaeroba organismer de inte får utsättas för syre. Därför följande steg sker under anaeroba förhållanden i en handskfacket (se 1.1). Med en pincett dränka hela kroppen av en termit arbetare i 70% etanol och snurra försiktigt i ca 10 s för att ta bort ytan föroreningar.
5. Ta bort den anställde från etanol och låt torka på en ren Kimwipe i ca 20 s. Använd en steril spetsig pincett för att hålla arbetaren buken och ta tag i spetsen på buken med en annan pincett för att försiktigt dra tarmen uppåt eller nedåt i en 45 graders vinkel. Om tarmen dras vid en rät vinkel och med för mycket kraft är det sannolikt att bryta sönder. Placera 10 guts i en droppe 100 l Trager U media på ett objektglas.
6. Pierce modet med ett par steril fina dissekera sonder att släppa protozoer och försiktigt flytta tarminnehåll med en 200 l pipett till en 1 ml mikrocentrifugrör innehåller 900 l Trager U medier. Efter möjliggör sedimentation av tarmväggen fragment (5 s), överföring 900 ìl av supernatanten till ett nytt rör.
7. Överför 10 ìl av protozoer kultur till en sigmacoted objektsglas och kontrollera tillståndet för protozoer under ett mikroskop med 200 gångers förstoring.
8. Förbered kontroll kulturer protozoer aerob Tetrahymena pyriformis, Amoeba sp. Euglena sp. Och toffeldjur sp. (Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC) samt en övernattning kultur av Escherichia coli i odlingssubstrat som rekommenderas av leverantören.

Experiment 2: Lägg ligand tillsammans med en fluorescerande färg till protozoer och bakteriekulturer för att testa för bindning till ytan membran och väggar cell

Vi använde tidigare biblioteken phage display (New England Biolabs Inc, Ipswich, MA) för att identifiera 19 heptapeptid sekvenser som binder till protozoer (protokoll finns på http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf). En ligand med en peptid sekvens (ALNLTLH) som visade likheter med förmodad glykoproteiner känd från Trypanosoma brucei membranet sammanställdes och kopplad till en C-terminal fluorescerande probe (EDANS, 5 - ((2-aminoetyl) amino) naftalen-1-sulfonsyra syra, λmax = 341 nm, λem = 471 nm) via solid state peptidsyntes (SSP) med hjälp av EDANS NovaTag harts (EMD Biosciences). Här kan vi visa att liganden binder till protozoer som var isolerad från termiter tarmen och andra viltlevande protozoer, men inte bakterier.

1. Kultur för protozoer som beskrivs i Exp. 1. Fix protozoer med 10% formaldehyd vid 4 ° C i 12 h.
2. Centrifugera protozoer lösning (30 xg, 10 min), kassera supernatanten och tvätta pelleten innehåller den fasta protozoer två gånger i 1 ml Trager U medier. Återsuspendera pelleten i 1 ml Trager U medier. Även fixa andra protozoer, och E. coli bakterier för kontroller.
3. Inkubera den fasta mikroorganismer i 1-2 timmar med lösning av syntetiskt ligand kopplad till fluorescerande färg EDANS (beredas i vatten) till en slutlig koncentration av 50 mikroM. Liganden löser sig bättre i vatten än Trager U medier.
4. Observera mikroorganismer under ett fluorescerande mikroskop med 400 gångers förstoring med en absorbans maximum vid 341 nm och ett utsläpp i det blå området vid 471 nm.

Experiment 3: Provning protozoacidal aktivitet liganden kopplad till en lytisk peptid in vitro (protozoer kultur)

Ett konjugat av liganden och lytiska peptid Hecate (Mutwiri et al. 2000) var tidigare syntetiseras på LSU Protein Facility.

1. Silaniseras material och förbereda termit tarmen protozoer kultur i den anaeroba handskfacket enar som beskrivs i Exp. 1.
2. Förbered kulturer av aerob kontroll mikroorganismer (t ex E. coli och frilevande protozoer arter T. pyriformis).
3. I den anaeroba miljön i handskfacket, pipett 6 alikvoter av 198 ìl av protozoer kultur i 0,5 ml Eppendorf-rör. Tillsätt 2 l av en 100 mikroM lösning av ligand-lytisk peptid till hälften av alikvoter (slutet koncentrationen 1 M) av termit protozoer tarmen kultur. Tillsätt 2 l vatten till den andra halvan av alikvoter (kontroller).
4. På bords, förbereda liknande alikvoter av E. coli och T. pyriformis med 1 mikroM lytisk peptid, ligand-lytisk peptid eller vatten.
5. Efter 1 h, överföring 10 l av varje protozoer kultur till bilderna. Jämför överlevnad behandlade protozoer den för kontroller under ett mikroskop med 200 gångers förstoring.
6. Efter 1 h, plåt 100 l på ca. 10 ^-4 utspädning av E. coli kulturer på BHI och inkubera vid 37 ° C över natten. Jämför antalet kolonibildande enheter på plattorna.

Experiment 4: Injektion av liganden kopplad till en fluorescerande färg i till termit hindgut

1. Dra nålar (Modell GD-1, 1 x 900 mm) med en Narishige PC-10 glas mikropipett avdragare med en tvåstegs värma nivå (65 och 48) för att få en spets storlek 20-30 ìm. Bekräfta spets storlek genom att mäta den under ett mikroskop med hjälp av en mikrometer.
2. Fyll en nål med ca. 30 ìl av 50 mikroM av fluorescerande märkt ligand suspenderade i vatten med en bifogad spruta. Fyll en annan nål med vatten för kontroll. Fäst en mikropipett (0,5 l kapacitet och 32 mm längd, Drummond Scientific Company) till en innehavare i ett mikromanipulator. Sätt en nål i insprutningssystemet innehavaren i en andra mikromanipulator. Ställ in första injektion parametrar till ca 1 s pulslängd och 10-12 psi injektion. Advance nålen långsamt i mikropipett och injicera lösningen med en pedal-drivna snabba elektroniska insprutningssystem med en pulslängd kontroll ansluten till ett kontrollerat kvävgas flöde, vilket garanterar att en konstant volym reproducerbart injiceras. Efter injektion, ta bort mikropipett och registrera längden av den injicerade lösningen med en skjutmått. Beräkna den injicerade volymen från kända parametrar mikropipetten. Justera trycket av kvävgas och pulsen längden att utvisa 0,3 l lösning i en enda injektion.
3. Pressa i slutet av en termit arbetare buken med mjuk pincett för att avlägsna eventuella exkret närvarande i ändtarmen. Immobilisera termit arbetare vid avkylning dem på is i 5 min.
4. Gör mottagare för att hålla termit arbetstagare genom att skära av 100 l pipettspetsar med skalpell blad. Skär av spetsen till en längd på 10 - 12 mm och användning enligt storleken på termiter.
5. Anslut mottagaren till mikromanipulator. Placera en arbetstagare på en petriskål på ryggsidan och aspirera arbetaren huvudet först in i mottagaren med en pump kväve sug så att ändstationen av arbetstagaren sticker ut från mottagaren.
6. Håll termit i mottagaren, noggrant innan de fyllda nålen med hjälp av mikromanipulator att infoga det i arbetstagarens anus. Injicera 0,3 l av lösningen (fluorescerande märkt ligand eller vatten för kontroller).
7. Placera arbetarna injiceras med ligand eller vatten i separata petriskålar med fuktiga filterpapper och förvara dem i 26 ± 2 ° C med 78% RH
8. Utrota tarmar från den injicerade termiter och samla protozoer efter 24 h som visas ovan i Exp. 1. Fix och observera protozoer som visas i Exp. 2.

Experiment 5: Testning protozoacidal aktivitet liganden kopplad till en lytisk peptid in vivo (injektion i termit hindgut)

1. Silaniseras material som beskrivs i Exp. 1.
2. Förbered en 500 mikroM lösning av ligand-lytisk peptid i vatten.
3. Följ steg 3,1) till 3,4) för att förbereda glas nålar, mottagare och arbetstagare termiter.
4. Efter de metoder som beskrivs i 3,5) injicera 0,3 ìl av ligand-lytisk peptid lösning (behandling) eller vatten (kontroll) i hindgut av 20 termit arbetare.
5. Håll termiter i 24 timmar, utrota inälvor från flera arbetare och observera tarminnehåll i mikroskop enligt beskrivningen i 3.6). och 3.7).
6. Så snart en död protozoer i termit tarmen bekräftas, hålla kvar behandlas termiter och kontroller i petriskålar med fuktig filterpapper och observera dödlighet dagligen.

Representativa resultat:

Experiment 1: Vanligtvis är framtarmen, midgut och hindgut framställda i ett stycke när förfarandet följs korrekt (Figur 1a). Den protozoer vistas i hög densitet i den anaeroba delar av hindgut och kan frigöras genom att sticka hål på hindgut med pincett (Figur 1b 1 & 2). Den största ProtoZOA arter i tarmen av Formosan underjordiska termit är spolformad s. grassii, som är 200-300 ìm lång och 150 ìm bred och kan ses med blotta ögat. Den näst största arten är päronformad H. hartmanni (50-140 ìm långa och 30-80 ìm bred). Den minsta arten är konformade S. leidyi (15-50 ìm långa och 8-30 ìm breda;. Lai et al 1983). Den protozoer arter visas i figur 2.

Under optimala odlingsbetingelser de tre arter av protozoer isolerade från tarmen på Formosan underjordiska termiter kommer att stanna levande och friska i minst 72 timmar i anaeroba Trager U media (figur 3a). Men om kulturen inte är optimala protozoer kommer att dö snabbt. Om det finns syre rester i media, kommer flödet av protozoer upphöra omedelbart. Om osmotiska trycket är för högt eller membran integritet äventyras ytan membranet i protozoer kommer bula ut och cellerna ruptur (Figur 3b). Om osmotiska trycket är för lågt eller membran äventyras, kommer protozoer krympa och krympa (figur 3c).

Experiment 2: Vi bekräftar att liganden kopplat till en fluorescerande prob bunden till alla tre arter av protozoer från hindgut av Formosan underjordiska termiter i detekterbara densiteter. Ligandbindande sker på hela cellytan (Figur 4). Bindningsställen är koncentrerad till den främre regionen av protozoer på axostyle (ett ark med mikrotubuli) och kärnan i P. grassii.

Vi observerade några ojämna autofluorescens av trä partiklar intas av protozoer. Det är dock autofluorescens oftast lätt att urskilja från specifik bindning av ligand, eftersom det inte finns någon autofluorescens av ytan, den axostyle och kärnan (Figur 4).

Vi upptäckte också fluorescens i alla testade fritt levande protozoer aeroba arter (Figur 5), vilket tyder på att liganden binder till strukturer generiska till protozoer. Men ingen ligandbindande observerats för E. coli.

Experiment 3: En mikroM av ligand-lytisk peptid dödade alla tre arter av protozoer från tarmen av Formosan underjordiska termit arbetstagare och fritt levande T. pyriformis in vitro i mindre än 10 min, medan kontrollerna stannade vid liv. Figur 6 visar en gradvis förlust av membran integritet termit tarmen protozoer som behandlas med ligand-lytisk peptid. Membran bula och bristningar, protozoer krympa och dö. Ingen skillnad sågs i antalet E. coli kolonier mellan behandlingarna av ligand-lytisk peptid och vatten. Lytisk peptid utan ligand dock minskat antalet E. coli kolonier avsevärt (Figur 7). Detta tyder på att infästningen av liganden till viss del skyddar inte målet mikroorganismer från lys.

Experiment 4: När 0,3 l 50 mikroM av fluorescerande markerade liganden var injiceras i hindgut av termit arbetare, bindning till P. grassii, S. leidyi och H. hartmanni bekräftades via fluorescensmikroskopi liknar Exp. 2 (Figur 4). Termite gut vävnad visade inte fluorescens.

Experiment 5: Injektion av 0,3 l 500 mikroM ligand-lytisk peptid dödade alla tre arter av protozoer i tarmen av Formosan underjordiska termiter inom 24h. Termiter dog inom 10 dagar efter förlusten av sin protozoer symbiotiska. Tidigare injiceras Husseneder och Collier (2009) samma koncentration av lytisk peptid till termit inälvor. Utan den bifogade ligand, tog det längre tid tills protozoer i tarmen (72 h) och termiter var döda (sex veckor). Detta tyder på att liganden ökar protozoacidal effektivitet lytisk peptider, troligen genom att binda den lytiska peptider till protozoer.

Figur 1. en: Formosan underjordisk termit tarmen på en bild som visar de viktigaste delarna av tarmen (fram-, mid-, hindgut), b 1 & 2: hindgut är genomborrad med pincett för att släppa tarminnehåll som innehåller protozoer.

Figur 2. De tre arter av flagellat protozoer som finns i hindgut av Formosan underjordiska termit: a) Pseudotrichonympha grassii, b) Holomastigotoides hartmanni, och c) Spirotrichonympha leidyi.

Figur 3. Protozoer i kultur, en) Sunda protozoer) b Protozoa med svällande membran, c) skrumpna protozoer.

Figur 4. Bekräftelse av bindning av liganden kopplad till en fluorescerande sond till termit tarmenprotozoer (uppifrån och ner: P. grassii, H. hartmanni, S. leydi), behandlade med fluorescerande märkt ligand och obehandlade kontroller (visar autofluorescens).

Figur 5. Ligand bindning till fritt levande aeroba protozoer, a) Tetrahymena, b) Amoeba, c) Euglena, och d) toffeldjur.

Figur 6. Behandling av protozoer med a) vatten (kontroll) och b) 1 mikroM ligand-lytisk peptid.

Figur 7. E. coli kolonier på plattorna (10 ^-4 utspädning): en) som behandlades med vatten (kontroll), b) behandlades med 1 mikroM ligand-lytisk peptid, c) som behandlades med 1 mikroM lytisk peptid.

Discussion

Ligand-lytisk peptider har med framgång använts för att effektivt rikta och förstöra cancerceller (Hans och Leuschner 2004, Hansel et al. 2007). Utifrån detta koncept har vi utvecklat en heptapeptid ligand som binder till ytan av protozoer i tarmen av Formosan underjordiska termiter och kopplat den till en lytisk peptid med målet att förstöra dessa obligata cellulosa-smälta symbionter i tarmen av termiter att uppnå termit kontroll (Husseneder och Collier 2009).

Vi bekräftade framgångsrikt bindning av ligand till de tre arter av protozoer i tarmen av Formosan underjordiska termiter in vitro och in vivo med hjälp av liganden med en fluorescerande prob (EDANS) med utsläpp i det blå området. Den autofluorescens av trä partiklar i lumen i termit tarmen och förtäras av protozoer stör detektion av specifika bindande. Även den erfarne observatören kan skilja mellan signalen från den markerade fluorescens ligand och autofluorescens (Figur 4), kan vissa modifieringar göra signal upptäckt mindre utmanande. Vi föreslår att du använder en fluorescerande färg längst-röda spektrat (t.ex. mPlum, Clontech Laboratories Inc.) där termiter tarmen och partiklarna trä visa betydligt mindre autofluorescens.

Vi visade att ligand-lytisk peptid i låga koncentrationer dödade alla tre arter av cellulosa-smälta protozoer från tarmen av Formosan underjordiska termiter in vitro och in vivo. Fastsättning av liganden till lytiska peptiden ökat giftighet för protozoer jämfört lytisk peptid ensam, medan den minskad toxicitet på icke-målorganismer, såsom E. coli, troligen eftersom liganden inte binda till bakterierna cellmembranet. Således kan det användas som aktiv ingrediens i beten för termit kontroll så snart som en effektiv leverans är utformat.

Vi kan inte leverera ligand-lytisk peptider till en termit koloni genom att mata peptider till termiter utan ändringar. Lytisk peptider snabbt smälta innan de når hindgut (Husseneder och Collier 2009). Därför använde vi termit lavemang att leverera peptider i hindgut för att testa sina protozoacidal aktivitet in vivo. För praktisk tillämpning kommer vi att testa om mata termiter proteashämmare före utfodring dem lytisk peptider kommer att resultera i tillräckliga mängder av lytisk peptider når hindgut och samtidigt behålla sina protozoacidal aktivitet. Också den syntetiska D-formen av lytisk peptid, som inte kan brytas ned genom tarmen proteaser (Husseneder och Collier 2009) skulle kunna ingå som en aktiv ingrediens i en termit bete. Det ultimata leverans kommer sannolikt att baseras på paratransgenesis, där en mikrobiell "trojansk häst" är genetiskt konstruerade för att leverera och sprida lytisk peptider i en termit koloni (Husseneder et al. 2005, Husseneder och Grace 2005, Husseneder och Collier 2009).

Användningen av ligand-lytisk peptider skulle ge en särskild strategi för att kontrollera insekter i stads-och jordbruks-miljöer fria från konventionella bekämpningsmedel. Agn-system kan utvecklas som introducerar mikroorganismer producerar ligand-lytisk peptider att rikta skadedjur, till exempel andra termiter och kackerlackor som om lita protozoer för att överleva. Sociala interaktioner kan sprida bakterier bland kolonin medlemmar (Husseneder et al. 2005, Husseneder och Grace 2005) och eliminera kolonin. Icke-sociala insekter också skulle kunna utformas på individuell basis av beten och specifika ligander utvecklade för att förstöra specifika vävnader.

Förutom att termit tarmen protozoer, ligand-lytisk peptiden presenteras i denna artikel också dödade fritt levande flagellat och ciliaten protozoer
(Tetrahymena, Amoeba, Euglena, toffeldjur). Detta kan vara användbart för utveckling av läkemedel mot protozoer parasiter som Leishmania, Trypanosoma, Trichomona och Plasmodium. Många av de läkemedel som för närvarande används för behandling av protozo parasiter hos människor och husdjur har hög ryggradsdjur giftighet och låg specificitet för parasiter, särskilt protozoer som har intracellulära utvecklingsstadier inom ryggradsdjur värd. Ligand-lytisk peptid komplex kan utformas för att selektivt rikta extracellulära protozoer i ryggradsdjur och ryggradslösa vektorer eller ytan av celler som innehåller intracellulära skeden av protozoer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL-2
EDANS	Novabiochem, EMD Millipore
Anaerobic glove box	Coy Laboratories, Inc.	Custom made
Intellus environmental controller	Percival Scientific, Inc.	I36NL
PC-10 Glass micropipette puller	Narishige International	PC-10
Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm)	Narishige International	GD-1
Leitz micromanipulators	Vermont Optechs, Inc.	ACS01
Microinjector	Tritech Research, Inc.	MINJ-1
Microcaps	Drummond Scientific	1-000-0005
LEICA fluorescence imaging system	Leica Microsystems	DMRxA2
LEICA dissecting scope	Leica Microsystems	MZ16
LEICA microscope	Leica Microsystems	DMLB
Olympus dissecting scope	Olympus Corporation	SZ61