Summary
نقدم إجراءات لإثبات أن يغاندس ربط غشاء سطح هذه هضم السليولوز الأوليات في أمعاء النمل الأبيض الفرموزية الجوفية باستخدام المجهر الفلورسنت ويغاندس أن يقترن الببتيدات lytic تقتل البروتوزوا
Abstract
نحن نعمل على تطوير مقاربة جديدة لمكافحة النمل الأبيض الجوفية التي من شأنها أن تؤدي إلى تقليل الاعتماد على استخدام المبيدات الكيماوية. النمل الأبيض الجوفية التي تعتمد على الأوليات في hindguts العمال في هضم الخشب بكفاءة. وقد تبين أن الببتيدات Lytic لقتل مجموعة متنوعة من الطفيليات (Mutwiri آخرون 2000) والبروتوزوا أيضا في أمعاء النمل الأبيض والجوفية الفرموزية ، Coptotermes formosanus (Husseneder وكولير 2009). الببتيدات Lytic هي جزء من الجهاز المناعي اللانوعي من حقيقيات النوى ، وتدمير الأغشية من الكائنات الحية الدقيقة (Leuschner وهانسيل 2004). الببتيدات معظم lytic ليس من المرجح أن يضر ارتفاع حقيقيات النوى ، لأنها لا تؤثر على حيادية كهربائيا أغشية الخلايا التي تحتوي على الكوليسترول العالي حقيقيات النوى (Javadpour وآخرون 1996). ويمكن توجيه عمل Lytic الببتيد لأنواع معينة من الخلايا من خلال إضافة ليجند. على سبيل المثال ، أفادت هانسيل وآخرون (2007) التي يمكن استخدامها الببتيدات lytic مترافق مع يغاندس سرطان الخلايا مستقبلات الغشاء لتدمير خلايا سرطان الثدي ، في حين أن الببتيدات lytic وحدها أو مترافق مع الببتيدات غير محددة لم تكن فعالة. الببتيدات Lytic كما تم مترافق للهرمونات البشرية التي تربط لمستقبلات على خلايا الورم لتدمير تستهدف خلايا البروستات وسرطان الخصية (Leuschner وهانسيل 2004).
في هذا المقال نقدم التقنيات المستخدمة للتدليل على وجود نشاط protozoacidal الببتيد lytic (هيكات) إضافة إلى يجند ببتيد سباعي الذي يربط لغشاء سطح البروتوزوا من أمعاء النمل الأبيض والجوفية الفرموزية. هذه التقنيات تشمل استئصال الأمعاء من العمال النمل الأبيض ، والثقافة اللاهوائي للأمعاء البروتوزوا (Pseudotrichonympha grassii ، Holomastigotoides hartmanni ،
Spirotrichonympha leidyi) ، وتأكيد أن يجند المجهرية التي تحمل صبغة الفلورسنت بربط الأمعاء النمل الأبيض وغيرها من الأوليات حرة المعيشة البروتوزوا ولكن ليس للبكتيريا أو أنسجة الأمعاء. نظهر أيضا أن يجند نفسه بالإضافة إلى الببتيد lytic يقتل بكفاءة الأمعاء البروتوزوا النمل الأبيض في المختبر (الثقافة البروتوزوا) والحية (microinjection في المعى المؤخر العمال) ، ولكن أقل من الببتيد bacteriacidal lytic وحدها. خسارة يؤدي إلى موت الكائنات ذات الخلية الواحدة من النمل الأبيض في أقل من أسبوعين.
في المستقبل ، فإننا سوف مهندس وراثيا الكائنات الحية الدقيقة التي يمكن أن يعيش النمل الأبيض في المعى المؤخر وينتشر عن طريق مستعمرة النمل الأبيض بأنه "حصان طروادة" للتعبير عن يجند - lytic الببتيدات التي من شأنها أن تقتل الطفيليات في الأمعاء النمل الأبيض ، وقتل لاحقا في مستعمرة النمل الأبيض . يجند - lytic الببتيدات يمكن أيضا أن تكون مفيدة لتطوير العقاقير لمكافحة الطفيليات.
Protocol
التجربة 1 : استخراج أمعاء النمل الأبيض تحت الظروف اللاهوائية البروتوزوا
- استخدام مربع المروحة (مختبرات كوي) في علبة القفازات أن يعمم باستمرار من خلال الهواء المجففة ونوع D - Stak باكس حافزا للسيطرة على مستويات الرطوبة والأكسجين ، ودرجات حرارة متفاوتة القضاء. ملء علبة القفازات مع دفق مستمر من النيتروجين لمدة 20 الى 30 دقيقة. رصد مستويات الأوكسجين مع جهاز استشعار الأوكسجين (C - التربيعية ، وشركة) لمدة 1 ساعة. استخدام النيتروجين للوصول والحفاظ على الظروف اللاهوائية عند الحاجة.
- إعداد Trager يو وسائل الاعلام (Trager 1934) وتعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.0. Sparge وسائل الإعلام تصفية تعقيمها في علبة القفازات مع خليط من الهيدروجين بنسبة 2.5 ٪ و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون والنيتروجين 92.5 ٪ لمدة 1 ساعة إلى إزالة بقايا الأكسجين.
- Silanize جميع المواد بما في ذلك شرائح المجهر ، وأنابيب microcentrifuge ، الماصات ، والأواني الزجاجية الخ المستخدمة في التجارب باستخدام Sigmacote لمنع امتصاص البروتوزوا الببتيدات أو على الأسطح (Sigmacote ، سيغما ، # SL - 2 ، http://www.sigmaaldrich.com/ الخ / medialib / مستندات / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf).
- يجب أن أمعاء النمل الأبيض منذ البروتوزوا هي الكائنات اللاهوائية بدقة لا تكون عرضة للأوكسجين. لذا يتم تنفيذ الخطوات التالية في ظل الظروف اللاهوائية في علبة القفازات (انظر 1.1). مع ملقط يغرق الجسم كله عامل النمل الأبيض في الايثانول 70 ٪ ودوامة بلطف لنحو 10 ثانية لإزالة الملوثات السطحية.
- إزالة عامل من الايثانول والسماح لتجف على Kimwipe نظيفة لنحو 20 ثانية. استخدام معقم غرامة يميل ملقط لعقد البطن عامل والاستيلاء على غيض من البطن مع زوج آخر من الملقط لسحب بلطف الأمعاء صعودا أو هبوطا في زاوية 45 درجة. إذا تم سحب الأمعاء في زاوية مستقيمة ومع الكثير من القوة فمن المحتمل أن يتفكك. 10 مكان الشجاعة في قطرة من وسائل الاعلام ميكرولتر 100 U Trager على شريحة المجهر.
- بيرس الشجاعة مع زوج من تحقيقات عقيمة تشريح غرامة للافراج عن البروتوزوا ونقل محتويات القناة الهضمية بلطف مع 200 ميكرولتر ماصة في أنبوب microcentrifuge 1 مل يحتوي على 900 ميكرولتر Trager يو وسائل الاعلام. بعد السماح للترسيب من الشظايا جدار القناة الهضمية (5 ق) ، ونقل 900 ميكرولتر من طاف لأنبوب جديد.
- نقل 10 ميكرولتر الثقافة البروتوزوا إلى شريحة المجهر sigmacoted والتحقق من حالة البروتوزوا تحت المجهر في التكبير X 200.
- تعد السيطرة على الثقافات الكمثرية الهوائية رباعية البروتوزوا ، الأميبة س. ، الحنديرة س. والمتناعلة س. (كارولينا شركة التموين البيولوجي ، برلنغتون ، NC) فضلا عن الثقافة بين عشية وضحاها من القولونية في وسائل الاعلام الثقافة الذي أوصت به المورد.
التجربة 2 : يجند إضافة إلى جانب وجود صبغة الفلورسنت لالبروتوزوا والبكتيريا الثقافات لاختبار ملزمة لأغشية الخلايا السطحية والجدران
كنا سابقا المكتبات عرض بالعاثية (نيو إنجلاند Biolabs المؤتمر الوطني العراقي ، ايبسويتش ، MA) لتحديد تسلسل 19 ببتيد سباعي التي تربط لالبروتوزوا (البروتوكولات المتاحة في http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf). تم تصنيعه ليجند مع سلسلة ببتيد (ALNLTLH) التي أظهرت أن التشابه جليكوبروتينات المفترضة المعروفة من الغشاء المثقبية البروسية وبالإضافة إلى التحقيق الفلورسنت C - الطرفي (EDANS ، 5 -- ((2 Aminoethyl) الأمينية) النفثالين - 1 - السلفونيك حامض ، λmax = 341 نانومتر ، 471 نانومتر = λem) عبر الصلبة الببتيد التوليف (SSPS) باستخدام راتنج NovaTag EDANS (EMD العلوم البيولوجية). هنا علينا أن نظهر أن يجند بربط البروتوزوا التي كانت معزولة من الأمعاء النمل الأبيض وغيرها من الدول الحرة التي تعيش البروتوزوا ، ولكن ليس للبكتيريا.
- وحيد الخلية الثقافة كما هو موضح في التصدير. 1. الإصلاح البروتوزوا مع الفورمالديهايد بنسبة 10 ٪ في 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة.
- الطرد المركزي الحل البروتوزوا (30 XG ، 10 دقيقة) ، تجاهل طاف ويغسل بيليه الذي يحتوي على البروتوزوا الثابتة مرتين في وسائل الاعلام Trager 1ml يو. إعادة تعليق بيليه في 1 مل الإعلام Trager يو. أيضا ، وغيرها من البروتوزوا الإصلاح ، وهاء. البكتيريا القولونية عن الضوابط.
- احتضان الكائنات الدقيقة ثابت لمدة 1-2 ساعة مع حل يجند توليفها بالإضافة إلى EDANS صبغة الفلورسنت (المعد في الماء) بتركيز نهائي من 50 ميكرومتر. ويجند يذوب في الماء أفضل من Trager U سائل الإعلام.
- مراقبة الكائنات الدقيقة تحت المجهر الفلورسنت في التكبير X 400 في حد أقصى إلى 341 نانومتر الامتصاصية وانبعاث في منطقة الزرقاء في 471 نانومتر.
التجربة 3 : اختبار النشاط protozoacidal من جانب ليجند الببتيد lytic في المختبر (الثقافة البروتوزوا)
تم تصنيعه من قبل ألف المتقارن ليجند وlytic الببتيد هيكات (Mutwiri وآخرون 2000) في مرفق البروتين LSU.
- Silanize المواد وإعداد ثقافة أمعاء النمل الأبيض البروتوزوا في علبة القفازات اللاهوائية فترةووصف ليالي في التصدير. 1.
- إعداد الثقافات من الكائنات الحية الدقيقة السيطرة الميكروب الهوائي (على سبيل المثال ، كولاي والأنواع التي تعيش بحرية البروتوزوا الكمثرية T.).
- في البيئة اللاهوائية لعلبة القفازات ، ماصة 6 aliquots من 198 ميكرولتر من ثقافة البروتوزوا إلى 0.5 مل أنابيب إيبندورف. إضافة 2 ميكرولتر من حل ميكرومتر 100 من يجند - lytic الببتيد إلى نصف aliquots (النهاية تركيز 1 ميكرومتر) للثقافة أمعاء النمل الأبيض البروتوزوا. إضافة 2 ميكرولتر من المياه إلى النصف الآخر من aliquots (الضوابط).
- على الفوق ، وإعداد aliquots مماثلة من E. القولونية وT. الكمثرية مع 1 ميكرومتر الببتيد الببتيد lytic يجند - lytic ، أو الماء.
- بعد 1 ساعة ، ونقل 10 ميكرولتر من كل ثقافة البروتوزوا على الشرائح. قارن بقاء تعامل البروتوزوا إلى أن الضوابط تحت المجهر في التكبير X 200.
- بعد 1 ساعة ، لوحة 100 ميكرولتر تقريبا. 10 -4 التخفيف من E. القولونية على الثقافات واحتضان بهي عند 37 درجة مئوية خلال الليل. مقارنة أعداد الوحدات مستعمرة تتشكل على لوحات.
التجربة 4 : حقن من جانب ليجند صبغة الفلورسنت في النمل الأبيض في المعى المؤخر
- سحب الإبر (النموذجي GD - 1 ، 1 X 900 مم) باستخدام مجتذب Narishige micropipette PC - 10 الزجاج مع مستوى المرحلة الحرارة المزدوجة (65 و 48) للحصول على حجم غيض من 20-30 ميكرون. تأكيد حجم غيض من خلال قياس تحت المجهر باستخدام ميكرومتر.
- ملء أحد إبرة مع كاليفورنيا. أوقفت 30 من 50 ميكرومتر ميكرولتر من يجند ملحوظ fluorescently في الماء باستخدام محقنة المرفقة. ملء إبرة أخرى بالماء للسيطرة. إرفاق micropipette (0.5 ميكرولتر القدرات و 32 ملم طول ، دروموند الشركة العلمية) لحامل في micromanipulator. نعلق إبرة لحقن حامل النظام في micromanipulator الثانية. تعيين المعلمات حقن أولية لمدة ما يقرب من 1 نبض ق و 10-12 رطل الحقن. دفع إبرة ببطء في micropipette وحقن محلول باستخدام دواسة يحركها عالية السرعة نظام حقن إلكتروني مع نبض مراقبة طول تعلق على تدفق الغاز النيتروجين للرقابة ، مما يضمن أن يتم حقن بتكاثر وحدة تخزين ثابتة. بعد الحقن ، وإزالة micropipette وسجل طول الحل باستخدام حقن الورنية الفرجار. حساب حجم حقن من المعلمات من المعروف micropipette. ضبط ضغط غاز النيتروجين وطول نبضة لطرد 0.3 ميكرولتر حل في حقنة واحدة.
- ضغط نهاية البطن عامل النمل الأبيض اللين مع ملقط لإزالة أي الحاضر الفضلات في المستقيم. شل عامل النمل الأبيض التي تقشعر لها الأبدان منهم على الجليد لمدة 5 دقائق.
- جعل استقبال العمال لعقد النمل الأبيض بقطع 100 نصائح ماصة ميكرولتر باستخدام شفرة المشرط. قطع رأس لمدة من 10 -- 12 ملم ، واستخدام وفقا لحجم النمل الأبيض.
- نعلق المتلقي إلى micromanipulator. مكان عامل على طبق بيتري على الجانب الظهري ونضح رئيس العمال لأول مرة في الاستقبال باستخدام مضخة شفط النيتروجين بحيث محطة ليبرز عامل من المتلقي.
- عقد النمل الأبيض في جهاز الاستقبال ، مقدما بعناية شغل الإبرة باستخدام micromanipulator لإدراجه في فتحة الشرج عامل. ضخ 0.3 ميكرولتر من الحل (يجند ملحوظ fluorescently أو الماء للضوابط).
- مكان العمال حقنوا يجند أو الماء في أطباق بتري ورقة منفصلة مع تصفية الرطوبة والاحتفاظ بها في 26 ± 2 درجة مئوية مع نسبة 78 ٪ RH
- استئصال الشجاعة من النمل الأبيض حقن وجمع البروتوزوا بعد 24 ساعة كما هو مبين أعلاه في التصدير. 1. الإصلاح ومراقبة الكائنات ذات الخلية الواحدة كما هو مبين في التصدير. 2.
التجربة 5 : اختبار النشاط protozoacidal من جانب ليجند الببتيد lytic في الجسم الحي (الحقن في المعى المؤخر النمل الأبيض)
- Silanize المواد كما هو موضح في التصدير. 1.
- يعد حل ميكرومتر 500 من الببتيد يجند - lytic في الماء.
- اتبع الخطوات من 3.1) من خلال 3.4) لإعداد الإبر والزجاج وأجهزة الاستقبال وعمال النمل الأبيض.
- وفقا للأساليب وصفها في 3.5) بضخ 0.3 ميكرولتر من محلول الببتيد يجند - lytic (العلاج) أو الماء (السيطرة) في المعى المؤخر العمال النمل 20.
- عقد النمل الأبيض لمدة 24 ساعة ، والشجاعة من استئصال عدة عمال ومراقبة محتويات الأمعاء تحت المجهر كما هو موضح في 3.6). و 3.7).
- في أقرب وقت أكدت وفاة الأوليات في أمعاء النمل الأبيض ، والحفاظ على ما تبقى النمل الأبيض المعالجة والتحكم في أطباق بتري مع فلتر ورقة رطبة ومراقبة وفيات يوميا.
ممثل النتائج :
التجربة 1 : عادة ما يتم الحصول على المعى الأمامي ، المعي المتوسط والمعى المؤخر في قطعة واحدة عند اتباع الإجراء بشكل صحيح (الشكل 1A). وحيد الخلية الموجودة في كثافة عالية في أجزاء من المعى المؤخر اللاهوائية ، ويمكن أن يكون صدر عن اختراق المعى المؤخر مع ملقط (1B الشكل 1 و 2). أكبر بروتوالأنواع زوا في أمعاء النمل الأبيض والجوفية الفرموزية هو على شكل مغزلي P. grassii ، وهو 200-300 ميكرون واسعة وطويلة 150 ميكرون ، ويمكن رؤيته بالعين المجردة. هذه الأنواع هي ثاني أكبر حاء على شكل كمثرى hartmanni (50-140 ميكرومتر طولا و 30-80 ميكرون). أصغر الأنواع هي على شكل مخروط S. leidyi (15-50 ميكرومتر طولا و 8-30 ميكرون ؛ لاي وآخرون 1983). يتم عرض أنواع البروتوزوا في الشكل 2.
في ظل ظروف مثلى الثقافة والأنواع الثلاثة من البروتوزوا معزولة من أمعاء النمل الأبيض الجوفية الفرموزية البقاء على قيد الحياة وسليمة لما لا يقل عن 72 ساعة في وسائل الاعلام U Trager اللاهوائي (الشكل 3A). ومع ذلك ، إذا كانت الظروف الثقافة ليست هي الأمثل والبروتوزوا يموت بسرعة. إذا كان هناك بقايا للأكسجين في وسائل الإعلام ، فإن حركة البروتوزوا تتوقف فورا. واذا ضغط التناضحي عالية جدا أو الغشاء للخطر سلامة غشاء سطح انتفاخ والبروتوزوا الخروج وتمزق الخلايا (الشكل 3B). إذا كان الضغط الاسموزي منخفض جدا أو المساس الأغشية ، وسوف تذبل والبروتوزوا يتقلص (الشكل 3C).
التجربة 2 : نحن أكد أن يجند بالإضافة إلى التحقيق الفلورسنت ملزمة لجميع الأنواع الثلاثة من البروتوزوا من المعى المؤخر من النمل الأبيض الجوفية في كثافة الفرموزية كشفها. ملزم يجند يحدث على سطح الخلية بأكملها (الشكل 4). وتتركز مواقع الربط في المنطقة الأمامية من الأوليات على الإبرة المحورية (ورقة من ميكروتثبول) ونواة في P. grassii.
لاحظنا بعض تألق ذاتي غير مكتمل من جزيئات الخشب ابتلاعها من قبل البروتوزوا. ومع ذلك ، تألق ذاتي هو عادة من السهل أن نستشف ملزمة محددة من يجند ، اذ لا يوجد اي تألق ذاتي من السطح ، والإبرة المحورية النواة (الشكل 4).
نحن أيضا الكشف عن مضان في جميع الأنواع اختبار الهوائية التي تعيش بحرية البروتوزوا (الشكل 5) ، مما يوحي بأن يجند بربط الهياكل العامة لالبروتوزوا. ومع ذلك ، لم يلاحظ أي ملزمة ليجند E. القولونية.
قتل واحد من ميكرومتر يجند - lytic الببتيد جميع الأنواع الثلاثة من البروتوزوا من الأمعاء العمال الفرموزية النمل الأبيض الجوفية وT. الحرة الحية : تجربة 3 الكمثرية في المختبر في أقل من 10 دقيقة ، في حين بقيت تسيطر على قيد الحياة. الشكل 6 يبين الفقدان التدريجي للسلامة غشاء الأمعاء النمل الأبيض البروتوزوا تعامل مع يجند - lytic الببتيد. انتفاخ وتمزق الأغشية ، البروتوزوا تذبل وتموت. لم يلاحظ أي فرق في عدد من E. المستعمرات القولونية بين المعالجات من يجند - lytic الببتيد والمياه. الببتيد Lytic مع عدم وجود يجند ، ومع ذلك ، انخفض عدد E. المستعمرات القولونية كبير (الشكل 7). هذا يشير إلى أن تعلق يجند لبعض الكائنات الحية الدقيقة تحمي درجة غير المستهدفة من تحلل.
التجربة 4 : عندما تم حقن 50 ميكرولتر 0.3 ميكرومتر ليجند fluorescently ملحوظ في المعى المؤخر العمال النمل الأبيض ، وملزمة لP. grassii ، S. leidyi وحاء وأكد hartmanni عبر المجهر مضان مشابهة التصدير. 2 (الشكل 4). لم أنسجة الأمعاء النمل الأبيض لا تظهر مضان.
قتل حقن 0.3 ميكرومتر 500 ميكرولتر يجند - lytic الببتيد جميع الأنواع الثلاثة من الأوليات في أمعاء النمل الأبيض الجوفية داخل الفرموزية 24H : تجربة 5. توفي النمل الأبيض في غضون 10 أيام بعد خسارة البروتوزوا بهم تكافلية. في السابق ، وحقن Husseneder كولير (2009) نفس التركيز من الببتيد lytic في أحشاء النمل الأبيض. دون أن يجند المرفقة ، استغرق الأمر وقتا أطول حتى البروتوزوا في القناة الهضمية (72 ساعة) ، والنمل الأبيض قد لقوا حتفهم (ستة أسابيع). هذا يشير إلى أن يجند زيادة الكفاءة protozoacidal من الببتيدات lytic ، وعلى الأرجح عن طريق ربط الببتيدات lytic لالبروتوزوا.
الشكل 1. أ : أمعاء النمل الأبيض الفرموزية الجوفية على شريحة عرض المقاطع الرئيسية للأمعاء (الصدارة ، منتصف المعى المؤخر) ؛ ب 1 & 2 : مثقوب المعى المؤخر مع ملقط للافراج عن محتوى الأمعاء تحتوي على الطفيليات.
الشكل 2. الأنواع الثلاثة من سوطي البروتوزوا وجدت في المعى المؤخر من النمل الأبيض والجوفية الفرموزية : أ) Pseudotrichonympha grassii ، ب) Holomastigotoides hartmanni ، ج) leidyi Spirotrichonympha.
الشكل 3. البروتوزوا في الثقافة ، والصحية) البروتوزوا ،) البروتوزوا مع انتفاخ الأغشية ب ، ج) ذبل البروتوزوا.
الشكل 4. تأكيد الملزمة للجانب يجند لتحقيق أمعاء النمل الأبيض لالفلورسنتالبروتوزوا (من أعلى إلى أسفل : P. grassii ، H. hartmanni ، S. leydi) ، وتعامل مع يجند ملحوظ fluorescently وضوابط غير المعالجة (إظهار تألق ذاتي).
الشكل 5. يجند ملزم لتحرير المعيشة البروتوزوا الهوائية ، أ) رباعية ، ب) الأميبة ، ج) الحنديرة ، والمتناعلة د).
الشكل 6. علاج الطفيليات مع الماء) (السيطرة) و (ب)) 1 ميكرومتر يجند - lytic الببتيد.
الشكل 7. E. المستعمرات القولونية على لوحات (10 تمييع -4) : أ) المعالجة بمياه (السيطرة) ، ب) المعالجة مع 1 ميكرومتر يجند - lytic الببتيد ، ج) المعالجة مع 1 ميكرومتر الببتيد lytic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد يجند - lytic الببتيدات استخدمت بنجاح لهدف على نحو فعال وتدمير الخلايا السرطانية (هانسيل وLeuschner 2004 ، هانسيل وآخرون 2007). بناء على هذا المفهوم ، قمنا بتطوير يجند ببتيد سباعي التي تربط إلى سطح الأوليات في أمعاء النمل الأبيض الفرموزية الجوفية وبالإضافة إلى الببتيد lytic بهدف تدمير هذه تلزم هضم السليولوز المتكافلة في أمعاء النمل الأبيض لتحقيق النمل الأبيض السيطرة (Husseneder وكولير 2009).
أكدنا بنجاح الملزمة ليجند لهذه الأنواع الثلاثة من الأوليات في أمعاء النمل الأبيض الفرموزية الجوفية في المختبر والمجراة باستخدام يجند مع التحقيق الذي تجريه فلوري (EDANS) مع الانبعاثات في المدى الأزرق. وتألق ذاتي من جزيئات الخشب في تجويف الأمعاء النمل الأبيض وتناولها من قبل البروتوزوا لا تتداخل مع اكتشاف ملزمة محددة. على الرغم من أن المراقبين من ذوي الخبرة ويمكن التمييز بين الإشارة من يجند مضان ملحوظ وتألق ذاتي (الشكل 4) ، قد جعل بعض التعديلات الكشف عن إشارة أقل تحديا. نقترح استخدام صبغة الفلورسنت في الطيف بعيدة الحمراء (على سبيل المثال ، mPlum ، Clontech مختبرات شركة) حيث أمعاء النمل الأبيض والخشب الجسيمات تظهر أقل بكثير تألق ذاتي.
أظهرنا أن يجند الببتيد - lytic في تركيزات منخفضة قتل جميع الأنواع الثلاثة من هضم السليلوز ، البروتوزوا من أمعاء النمل الأبيض الفرموزية الجوفية في المختبر والمجراة. ازداد تعلق يجند لالببتيد lytic السمية للالبروتوزوا مقارنة الببتيد lytic وحدها ، في حين خفضت السمية للكائنات غير المستهدفة ، مثل E. القولونية ، وعلى الأرجح لأنه لم يجند لا ربط لغشاء الخلية البكتيريا. وبالتالي ، يمكن تطبيقه كعنصر نشط في الطعم السام لمكافحة النمل الأبيض حالما يتم تصميم نظام تسليم كفاءة.
لا يمكننا تقديم يجند - lytic الببتيدات إلى مستعمرة النمل الأبيض عن طريق تغذية الببتيدات لالنمل الأبيض دون تعديل. يتم هضمها بسرعة الببتيدات Lytic قبل أن تصل إلى المعى المؤخر (Husseneder وكولير 2009). لذا ، كنا الحقن الشرجية النمل الأبيض لتقديم الببتيدات في المعى المؤخر لاختبار نشاطهم protozoacidal في الجسم الحي. التطبيق العملي لاختبار ما إذا كنا سوف تغذي مثبطات الأنزيم البروتيني النمل الأبيض قبل إطعامهم الببتيدات lytic سوف ينتج كميات كافية من الببتيدات lytic بلوغ المعى المؤخر مع الحفاظ على نشاطهم protozoacidal. أيضا ، D - الاصطناعية شكل lytic الببتيد ، والتي لا يمكن هضمها من قبل الأمعاء البروتياز (Husseneder وكولير 2009) ، يمكن أن تدرج كعنصر نشط في الطعم النمل الأبيض. من المرجح أن يكون نظام التسليم النهائي أن تستند paratransgenesis ، حيث هندستها وراثيا "حصان طروادة" لتسليم الجرثومية وانتشار الببتيدات lytic في مستعمرة النمل الأبيض (Husseneder وآخرون 2005 ، وغريس Husseneder 2005 ، Husseneder وكولير 2009).
فإن استخدام يجند - lytic الببتيدات توفير نهج محدد للسيطرة على الحشرات في البيئات الحضرية والزراعية خالية من المبيدات التقليدية. ويمكن وضع أنظمة الطعم الذي يعرض الكائنات الحية الدقيقة المنتجة يجند - lytic الببتيدات لاستهداف أنواع الآفات ، مثل النمل والصراصير الأخرى التي تعتمد على البروتوزوا من أجل البقاء. يمكن أن التفاعلات الاجتماعية انتشار الميكروبات بين أعضاء مستعمرة (Husseneder وآخرون 2005 ، وغريس Husseneder 2005) ، والقضاء على مستعمرة. غير الاجتماعية الحشرات ويمكن أيضا أن تكون موجهة على أساس فردي عن طريق الطعم ويغاندس محددة وضعت لتدمير أنسجة معينة.
بالإضافة إلى أمعاء النمل الأبيض البروتوزوا ، ويجند الببتيد - lytic المعروضة في هذه المقالة كما قتل حرة المعيشة سوطي والبروتوزوا هدبي
(رباعية ، الأميبة ، الحنديرة ، المتناعلة). قد يكون هذا مفيدا لتطوير عقاقير لمكافحة الطفيليات مثل الليشمانيا ، المثقبية ، Trichomona ، والمتصورة. العديد من الأدوية المستخدمة حاليا لعلاج الطفيليات من البشر والحيوانات الداجنة والحيوانات الفقارية سمية عالية ومنخفضة النوعية للطفيليات ، وخاصة البروتوزوا التي مراحل الحياة داخل الخلايا المضيفة في الفقاريات. ويمكن تصميم المجمعات الببتيد يجند - lytic لاستهداف انتقائي خارج الخلية البروتوزوا ضمن الفقاريات أو ناقلات اللافقارية أو سطوح الخلايا التي تحتوي على مراحل داخل الخلايا وحيد الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر الدكتور أليسون ريتشارد ، المدير السابق للمنشأة الببتيد LSU لتوليف يجند الفلورسنت ، ومركز لبحوث التكنولوجيا الحيوية Interdisciplinaray ، الجبهة المتحدة لتركيب الببتيد يجند - lytic ، ومرفق مجهر سوكولوفسكي لتوفير الوصول إلى مضان المجاهر. تم توفير التمويل من قبل برنامج التنمية SERDP الاستكشافية (SEED) في وزارة الدفاع ، وزارة الطاقة ووكالة حماية البيئة ، والتكنولوجيا الحيوية AgCenter برنامج الفريق المتعدد الاختصاصات واية لويزيانا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | |
| EDANS | Novabiochem, EMD Millipore | ||
| Anaerobic glove box | Coy Laboratories, Inc. | Custom made | |
| Intellus environmental controller | Percival Scientific, Inc. | I36NL | |
| PC-10 Glass micropipette puller | Narishige International | PC-10 | |
| Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm) | Narishige International | GD-1 | |
| Leitz micromanipulators | Vermont Optechs, Inc. | ACS01 | |
| Microinjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 | |
| Microcaps | Drummond Scientific | 1-000-0005 | |
| LEICA fluorescence imaging system | Leica Microsystems | DMRxA2 | |
| LEICA dissecting scope | Leica Microsystems | MZ16 | |
| LEICA microscope | Leica Microsystems | DMLB | |
| Olympus dissecting scope | Olympus Corporation | SZ61 |
References
- Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. Conjugates of lytic peptides and LHRH or βCG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases. Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).
- Husseneder, C., Collier, R. E. Paratransgenesis for termite control. Insect Symbiosis. Bourtzis, K., Miller, T. A. 3, CRC Press LLC. Boca Raton, Florida. Volume 3 361-376 (2009).
- Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites. Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).
- Husseneder, C., Grace, J. K. Genetically engineered termite gut bacteria deliver and spread foreign genes in termite colonies. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 360-367 (2005).
- Javadpour, M. M., Juban, M. M., Lo, W. C., Bishop, S. M., Alberty, J. B., Cowell, S. M., Becker, C. L., Mc Laughlin, M. L. De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity. J. Med. Chem. 39, 3107-3113 (1996).
- Lai, P. Y., Tamashiro, M., Fuji, J. K. Abundance and distribution of the three species of symbiotic protozoa in the hindgut of Coptotermes formosanus (Isoptera). Proc. Haw. Entomol. Soc. 24, 271-276 (1983).
- Leuschner, C., Hansel, W. Membrane disrupting lytic peptides for cancer treatments. Curr. Pharm. Des. 10, 2299-2310 (2004).
- Mutwiri, G. K., Henk, W. G., Enright, F. M., Corbeil, L. B. Effect of the Antimicrobial Peptide, d-Hecate, on Trichomonads. J. Parasitol. 86, 1355-1359 (2000).
- Trager, W. The cultivation of a cellulose-digesting flagellate, Trichomonas termopsidis, and of certain other termite protozoa. Biol. Bull. 66, 182-190 (1934).
