人間の舌から茸（味）乳頭を収集する手法

Summary

味覚伝達の分子メカニズムの知識は、最近、主な原因動物モデルを使用して、大きな進歩を遂げました。しかしながら、ヒト組織における哺乳類のワラントの研究間の味の感度と特異性の広い多様性。私たちは、人間の舌で乳頭からの生活の味細胞を収集するために生検の手法を説明します。

Abstract

味の感覚は、人間の生活にとって非常に重要です。それは潜在的に摂取される食品の品質について、身体を通知し、消化のために消化管を準備する代謝プロセスを刺激する。着実な進歩は、味覚変換を（確認のため、Breslinさんとスペクター^、2008年）の基礎となる初期の生化学的および分子事象の理解に向けて作られている。しかし、現在までの進捗状況は、主に動物モデルに起因している。まだ、受容体の特異性と受容体密度の著しい違いが種間で異なるため、人間の味覚変換は、人間の味覚組織を使用することによって理解されるであろう。ここでは、味蕾を含む直径約0.5mm角の丸いピンクの前部構造など目に見える人間の茸状乳頭に、、収集する生検法を説明します。これらの生検乳頭は、in situハイブリダイゼーション、免疫組織化学で実行可能な味蕾細胞の分離、そして、分子生物学の技法により、味に固有の新規タンパク質の同定を含む、いくつかの目的のために使用されています。

Protocol

1。導入と一般的な考慮事項

一般的な手順は、湾曲したバネマイクロを使用して、その麻酔領域から茸（味）乳頭の数（6-8）の除去に続いて前方舌の背側表面の小さな（1cm ^2の ）領域、の局所麻酔を行います - はさみ（マクファーソン- Vannasタイプ＃SR 5603、Roboz、ロックビル、MD）。削除された茸状乳頭は、約0.25 mm ^3にそれぞれです。各乳頭と共に除去はほとんど非乳頭（味）上皮組織があります。 3〜5週間後のこの分野における新たな乳頭の形態と機能して味蕾（スピールマンとブランド、未発表の観察を）取り戻す。味の材料のこの小さな量の除去後の食品の味や香りに顕著な影響はありません。成人の人間の舌で個々の味蕾を数えている研究から、それは人間の舌が約5,000の味蕾が含まれていることを推定することができます。この場合の手続きは、多くても、これらの味蕾の20〜25（平均で、人間の茸状乳頭あたり〜3.5から4味蕾^）2、または合計の約0.4％が削除されます。さらに、この組織の外科的損失に伴う痛みはありません。一つは、針が舌に入ると、唯一の注射部位の軽い痛み、当然、感じている。麻酔がオフに着用した後に、そこに一日未満のために軽度の不快感は時々ですが、この不快感は、誤ってものの舌を"噛む"の後に何one経験よりもはるかに少ないです。

過去数年間で私たちは、麻酔が含まれていない代替手順を開発しました。組織を除去するための手法は、両方で同一です。プロシージャ内の唯一の違いは、外科医はもはや麻酔が解決された1cm ^2の直径の領域に限定されていないことです。むしろS /彼は著名な乳頭が表示される舌の背側表面上に任意のサイトを選択することができます。の投与に伴う痛みと比較した場合、削除された乳頭の総数が正常に実行した場合、または麻酔なしで、両方の技術で6〜8に限定されている6-8茸状の味覚乳頭を除去するの不快感はあまり問題と考えられている局所麻酔の両方の手続きを受けた個人の一般的な調査では、すなわち、とと麻酔なしで、対象者の圧倒的多数は、将来のすべての生検における局所麻酔なしで済ますということを示した。このテクニック（AIS）と麻酔なしで生検を行った著者が教えた数人の同僚が開発した外科医は、自分自身でそれを試みたと不快感が一時的なものとかむ舌のそれよりも小さいと見なされていることを証言している。彼らは麻酔なく、ある乳頭の除去を試みることをいとわないなら最後に、生検することに同意した個人の数十を求めていたと、彼らは麻酔を受けるというあまりにも痛いようにそれを判断する場合、すべての乳頭の削除を続行することに合意した麻酔。

全体の生検は、5分から10分を上回ってはいけません。麻酔が使用される場合は別の2-3分が追加されます。生検は通常、朝の時間で行われる。生検前に、ボランティアは2時間の予定開始時刻の前に軽食を食べるように指示されます。生検では、書面によるインフォームドコンセントが得られる。生検時の除外基準は、（例えば、あらゆる消化器疾患、神経変性疾患、癌、血液dyscrasias、局所麻酔薬にアレルギー、等）よりも大きい心拍数とのそれらを薬で制御されるかどうかに関係なく、重篤な慢性疾患を持つものが含まれています100または60未満、145または100未満より大きい収縮期血圧、拡張期血圧が90より大きいまたは60未満、および被験者が研究に参加できることを外科医の意見。

最後に、生検の手続きは、我々がしばしばmRNAの質の低下が指摘したように組織の整合性が急速に失われているので、組織が検査のために処理される同一施設で実施されるべきであることを考慮することが重要です。これらの問題を最小限に抑えるために舌の組織は、可能な限り迅速に処理されるべきです。

2。主題の準備

1. 被験者は、歯科椅子やヘッドレストと座席に座っている。
2. 生検時の心拍数と血圧をチェックしてください。血圧、心拍数や口頭能力の範囲外の対象と秋万一、外科医は彼/彼女は医師を見て即座に予約を行うことを予告することをお勧めします。
3. 口腔乾燥、地理的な舌または舌病変の指標に注意を払って、一般的な組織の健康のための口腔内を検査する。舌病変や口腔乾燥症を含む口腔疾患の兆候を、示す任意の件名は研究から除外されています。経口cavitからすべての残骸を削除するには、水で口をすすぐために被験者に指示Y.必要に応じて舌が麻酔の注射時に舌に運ばれる可能性プラークやゴミを除去するために使い捨ての舌の解体作業員、で洗浄される。外科医は、口腔内から伸びるように舌の前方¼を保持するために手袋をはめた手で滅菌ガーゼパッドを使用しています。
4. 麻酔が使用されている場合、28ゲージと1ccツベルクリン注射器Xエピネフリン（1:100,000）で0.25 mLのリドカイン（2％）を含む½"針はゆっくりとちょうど舌の前部の背側表面の下にあるサイトに注入される。麻酔のサイトには、その後の研究でリドカインによる干渉を避けるために、コレクションのサイトへの遠位である。比較のために、注入されたリドカインの量（0.25 mL）を、通常、歯科治療における神経ブロック（0.8 mLを1 mL）溶液に指定された量の約4分の1です。針の挿入後、麻酔薬の注射の前に、吸引は血管が打たれないことが保証されます。それは大きな船が近くに背面に打たれることを解剖学的にそうであるにもかかわらず、このような対策は取られます。背側表面の唯一の動脈は、舌背動脈は主に組織の収穫が起こる前第三に、より後方に位置する小さな血管です。舌の腹側表面上で動作する大規模な舌動脈と舌静脈は、はるかに麻酔薬^3を受け取る背側領域から削除されます。麻酔領域1 cmの周囲の組織に比べて若干薄いように見えます。それは小さな血管を圧縮するので、これは組織の腫れによるものです。また、エピネフリンの血管収縮作用によるものです。約1分後、プローブは、しびれのための領域をテストするために使用されます。エリアが麻痺されていない場合、目の注射（0.1〜0.2 mL）を与えることができる。

3。舌乳頭の除去技術

1. 被験者の舌の前方四半期は（右手で生検を行う場合）滅菌ガーゼに包まれた（図1）と外科医の左手に保持されています。ガーゼの一角は、外科医は、唾液の自由な舌を拭くために許可するように開いたままになります。舌は、不必要な不快感を引き起こすことがないよう、しっかりと保持、しかし、もちろんされている必要があります。左手の人差し指の先端が直接生検が行われているサイトの下の舌の下に配置されている。上向きの人差し指を押すことで、舌は乳頭が容易に生検のために突き出ること指のチップの上に張らなります。
2. 生検のための乳頭を選択するための基準：味覚​​乳頭の形と大きさによる周辺filliform乳頭と簡単に区別できます。茸状乳頭は周囲からのラウンドとやや孤立です。そのすぐ近くにfilliform乳頭（図2A、青の矢印）を欠いた円形のスペースがあります。この空間は、直径約1 mmである。茸状乳頭のもう一つの特徴は、若年者のほとんどの茸状乳頭の上に見えるの拡張キャピラリー分枝である。樹枝状分岐が位置茸状乳頭が簡単になりますが、彼らはその乳頭の味蕾の存在の良い予測因子とは限りません。ルールとして、1つはフロントエンドに向かって収穫開始し、次の組織のコレクションのサイトを妨げあらゆる毛細血管出血を避けるために、さらに離れて舌の先端から移動します。
3. 一度良い乳頭はバネマイクロシザー（マクファーソン- Vannas、湾曲した、シャープな刃先5mmのくし、先端の幅0.2ミリメートル全体の長さ3"（RS - 5603、Roboz）それをクリップするために使用されますが、確認されている。近い交点に反対のブレードと、むしろ、限り刃の内側が可能（図1、拡大画像と図3）として、効果的には、加工用刃の先端を使用してはならないのマイクロ手術用ハサミを使用するには。乳頭の除去は、はさみの一つ切削移動（図1）を実現しています。標的と乳頭が表示されたオープンなブレード内部にさらに、より効果的にカットです。はさみの全体的な位置が平行でなければならないことを注意すべきである舌の背側表面に。
4. 外科医は、除去のための乳頭を識別しようとしていると時々舌は乾燥になります。一度乾燥、はっきりと茸状乳頭ているかを確認するために、オペレータの能力がより困難になり、非常に困難乳頭上のブレードの摺動になります。過度に乾燥した舌は、通常、繊細な手術の移動が少なく制御可能作る舌に金属の刃の棒になります。主題は彼/彼女の口を閉じて、唾液が舌の表面を接触させると、処理をするのに役立ちます。過度に濡れた舌がどちらか良いではありません。一舌を保持するために使用するガーゼのコーナーを使用すると、このプロセスに役立ちます。
5. 発生しない任意の毛細管出血は、滅菌ガーゼでブロッティングによって扱われます。出血は通常、数分以内に停止します。ユートと追加の組織の収穫を妨げることはありません。乳頭は舌の上皮表面よりも上に、と茸状乳頭の唯一の上位3 / 4が（図2B）に削除されているため、味蕾を示す茸状のその部分は、少し出血が予想されます。
6. 小さ ​​なデュモン鉗子（パターンタイプ）を使用して、削除した乳頭を冷やした基本リンガー緩衝液（130 mMのNaCl、5mMのKClを、1mMのCaCl _2、1mMのMgCl _2、1mMののNa -ピルビン酸、20mMのHEPES - Naはに配置されます、pH 7.2の;〜305ミリosmolsの浸透圧）、その後の操作のための。鉗子のブレード間乳頭を挟まない決してすることが不可欠です。組織は非常に壊れやすく、細心の注意を払って取り扱ってください。
7. 乳頭を除去した後、被験者は10〜15分のための椅子に残ります。各被験者は、その麻酔舌を噛まないように、しかし、残りの部分で彼らの舌を保つように言われている。被験者は視覚的に参加する外科医によって監視されるべきである。麻酔は約30〜60分で脱ぎ履きが期待される。乳頭除去のサイトは生検後に少し痛むかもしれないので、それらはどちらか極端に寒い場所や暑いなスパイシーまたはホット（温度）食品、炭酸飲料または飲料を認識するように指示されています。さらに表示が唾液の任意のわずかな赤みを帯びた色合いが正常であると血栓の溶解時に停止することを被験者に与えられます。
8. 被験者は、乳頭が削除されたサイトの評価のための乳頭の除去後30日から40日見られている。この時間によって味覚乳頭は完全に再生成されているはずです。

5。代表的な結果

収集された組織は 、in situハイブリダイゼーション、カルシウムイメージング、パッチクランプ法と組織培養の免疫組織化学、RT - PCRに使用できます。正しく実行するときに乳頭の外観は、直径0.5〜1ミリメートル（図2B）については、、白を探して健康的です。

免疫組織化学のために収集された乳頭は、既存の、公開されたプロトコル⁴に基づいて処理されます。 paraformaldehide固定味覚乳頭からの典型的な味蕾は、図4Aに示されています。

生検乳頭は、酵素的に味蕾細胞の解離を達成するために^5を扱うことができます。酵素解離した後、細胞は4℃で加湿ペトリ皿で​​4時間まで維持することができます。この状態ではそれらは単一のセルPCR（図4B）、カルシウムイメージングなどに使用することができます。

細胞はさまざまな形状を示す、一つとして細いとバイポーラ（図5Aおよび5B）であること、多くは味蕾細胞に期待される。細胞を収集またはCaイメージングを行うときは、顕微鏡下で約20分後、細胞はアポトーシスblebs（図6Aと6B、矢印）と、それらの多くは円形になるの開発を始める。私たちの研究室で開発された技術を用いて、細胞は、図5Aおよび5Bに示すように、パッチピペットを用いて個別に取り上げられた。

前述したように、乳頭は5〜8週間後に再生するために始める。図7Aは、8茸状乳頭は、ボランティアの舌がない麻酔を使用していない左側から削除された舌の外観を示しています。乳頭がオフsnippedした8わずかな赤みを帯びた斑点を、注意してください。出血は、手術後に観察されていません。本画像は、生検後10分を取られた。図7Bは、40日生検後に見られる同一の被験者の舌の画像です。再成長しているすべての乳頭に注目してください。再生乳頭が機能しているかどうかを判断するために我々は、まったく同じ乳頭を含む第二生検に同意する私たちのボランティアを尋ねた。正しく我々は、収穫を再計画していた適切な乳頭を識別するには、我々は最初の場所で削除し、初期生検後40日後に同じボランティアの舌の上に重畳した8乳頭に適合グリッド（7C図）を生成。舌の輪郭とマージンからグリッドまでの距離によって助けられ、一度に識別、我々はまったく同じ乳頭のいくつかを取り除き、免疫組織化学のためにそれらを処理している。図4Aは、これらの乳頭の一つです。味蕾の概要（黄色）とホスホリパーゼCβ2（PLCβ2）、2型味細胞伝達関連酵素に対して免疫染色に注意してください。これらのデータは、生検の手順を使用すると、本明細書に記載のように、茸状乳頭は、場所性、機能の味覚にも持っている40日間で十分に再生することを示している。

図1。被験者の舌の前方四半期は、滅菌ガーゼに包まれ、外科医は左手に保持されます。舌をしっかりと保持する必要があります。右側の拡大画像はハサミとブレードとの関係で乳頭の位置の適切な位置を示しています。

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図2。 （）茸状乳頭は、青色の矢印で示されています。これらは、ややその周辺やそのすぐ近くにfilliform乳頭を欠いている円形のスペースがあるから隔​​離丸い構造になっています。それが削除されているマイクロシザー秒後にバネの先端に（B）茸状の味覚乳頭。

図3。ミラーと無麻酔を使用して、茸状乳頭の自己生検。挿入図は、舌の背側表面と平行でなければならないはさみの全体的な位置を、示しています。適切とatraumatically行われれば、麻酔は事実上すべてボランティアによってforgoneれる。

図4 A.味蕾の免疫組織化学。茸状乳頭は、ホスホリパーゼβ2に対する抗体を用いてノマルスキー光学系により可視化し、赤色蛍光タンパク質でタグ付け。味蕾といくつかの標識された味細胞の輪郭が黄色で表示されます。

候補酸味受容体、酸感受性イオンチャンネル1（ASIC1）のB. RT - PCR。 M =マーカー。 〜4レーン1は、4種類のボランティアからASIC1のための単一細胞RT - PCRした。収集した後、茸状乳頭は酵素的に解離された、細胞が個々にピックアップし、ASIC1の発現が行われた。レーン2と4はASIC1の通常の表現を持っていた。

図5。パッチピペットを使用してピックアップされる単一の味細胞のA.イメージ。大規模な上皮細胞は、左下隅（5A）に表示されます。二つの赤血球は、パッチピペット上記とガラスバレルの後ろに表示されます。味細胞は約30〜50ミクロン長さ約6ミクロンの幅です。参考のために、赤血球は直径7〜8ミクロン程度である。 B.は、4つの上皮細胞に囲まれた別の味覚受容体細胞を示しています。味細胞は、くっきりした写真になります。

図6。アポトーシスblebsを（味細胞、矢印に接続されているラウンドblebsのようなゴースト）の開発を開始した細胞のA.画像。ここに示されているように、その外観が変更されたときB.細胞はもはや収穫されていません。

図7。ない麻酔を使用していない8味覚乳頭の除去10分後にA.。手術のサイトでは、やや赤みを帯びた斑点として表示されます。出血は気づいていない。
40日生検後に同じ舌を。B.。再生すべての乳頭に注目してください。再成長として削除乳頭を識別しやすくするために、グリッドが右側の画像上のサイトで作成され、左側の画像で再生された乳頭を介してシフトした。
C.は、再生された乳頭は同じ場所に登場。再生乳頭が（図4Aを参照）機能的な味細胞を含有することを明らかに免疫組織化学が続くこのグループから再び乳頭を収穫。

Discussion

ヒト細胞を使用する1つの顕著な利点は、それらの特異性です。詳細にここで説明する手順は、人間からの味覚受容体細胞の単離のための舌組織を提供します。これらの味細胞は味覚情報の伝達のための重要な分子を発見しようとする、分子の研究に使用し、刺激する味細胞の活動を監視するカルシウムイメージング研究のために。することができますさらに、このプロシージャによって提供される舌の組織は、in situハイブリダイゼーション 、このような免疫組織化学などの様々な手法で分析し、そのようなリアルタイム定量的単一細胞PCRを含むポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、などの分子の手順については、個々の細胞を取り込むことができますすることができます。この手順は、その意味で味のpsychophysically生検を施行する前に評価することができる個人に実行できるので、それは（例えば、Huque らを参照してください。2009）味覚異常の責任分子の詳細を明確に把握することが可能です。この生検方法には、味蕾の細胞に富んで生存し、代謝的に無傷の単一細胞調製物の生産、したがって、これらの細胞にパッチクランプ記録を実行する機能が可能になります。このテクニックを使用して、今後の研究は人間に固有の処理だけでなく、疾患や薬剤誘発性の状態とこれらの異常を治療する療法を開発するの味覚の異常を基礎と解読の分子機構味覚変換の我々の理解を増加させることができなかった。

最後に、我々の観察の結果は、"穴、"頻繁に近いarborizationsに茸状乳頭に記載し、一般的には味蕾の細孔であると考え、の存在は、実際には、味蕾の存在の良い予測因子ではないことを。示しているちょうどこれらの穴の性質が何であるか、または彼らが行うことが何の関数、我々は知らない。

我々は、この手順を始めて以来8年間で、我々は繰り返し4000味覚乳頭上に数十人のボランティアから収集している。二つの有害な発生率は、局所麻酔に関連する両方の舌の一時的な腫れにつながったが、副作用なしで、48時間以内に解決。滅菌と非外傷性の条件下で、適切に行われれば、この方法は安全で効果的です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McPherson-Vannas. Curved, sharp cutting edge 5mm. Comb, tip width 0.2 mm overall length 3"	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5603, Roboz
Small Dumont forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4915, Roboz