Preparación de corazón de rata altamente acoplado mitocondrias

Summary

Se describe el protocolo а para el aislamiento de corazón puro, una rata muy unido las mitocondrias de los estudios funcionales o estructurales de la bioenergética celular, mediciones biofísicas, la proteómica y el ADN mitocondrial y el análisis de los lípidos.

Abstract

La función de la mitocondria en la generación de ATP celular en el proceso de fosforilación oxidativa es ampliamente reconocida. Durante las últimas décadas ha habido avances significativos en nuestra comprensión de las funciones de otros mitocondrias que la generación de energía. Estos incluyen su papel en la apoptosis, actuando como una señal de orgánulos, desarrollo de los mamíferos y el envejecimiento, así como su contribución a la coordinación entre el metabolismo celular y la proliferación celular. Nuestra comprensión de los procesos biológicos modulada por las mitocondrias, se basa en métodos robustos para el aislamiento y la manipulación de las mitocondrias intactas de tejidos de los animales de laboratorio. Las mitocondrias de corazón de rata es una de las preparaciones más comunes de los estudios anteriores y actuales del metabolismo celular incluyendo estudios sobre animales knock-out.

A continuación se describe un método detallado rápido para el aislamiento de las mitocondrias intactas con un alto grado de acoplamiento. Tal preparación de corazón de rata mitocondria es un objeto ideal para la investigación funcional y estructural de la bioenergética celular, el transporte de biomoléculas, los estudios proteómicos y análisis de ADN mitocondrial, las proteínas y los lípidos.

Protocol

Introducción

Las mitocondrias de corazón de rata es una de las preparaciones más comunes de los estudios anteriores y actuales del metabolismo celular. Se pueden obtener de forma rápida y fiable en gran cantidad de tipo silvestre o animales knock-out. El procedimiento general consiste en la digestión del tejido por la tripsina, fraccionamiento y centrifugación diferencial.

Hay varias condiciones que han de mantenerse durante el aislamiento de las mitocondrias de varios tejidos, incluyendo el corazón (Fig. 1).

• El tejido tiene que ser bien picada, ya que afecta directamente el rendimiento de las mitocondrias obtenidas. El tejido del corazón que es mejor para picar con pequeñas tijeras curvas y puede ser seguido por el uso de un triturador de tejidos Latapie, o si un triturador de tejidos no está disponible, una prensa de ajo con una salida de diámetro de los agujeros de alrededor de 1,0 mm de diámetro.
• Es necesario para mantener la temperatura de las soluciones a cada paso. Por lo tanto, todo el procedimiento ha de llevarse a cabo en una habitación fría y todos los instrumentos y las soluciones tienen que estar preparados y refrigerados con antelación. Si las condiciones de temperatura no se mantienen estables varias propiedades de la preparación se puede perder. La estructura mitocondrial es muy sensible a las heladas por lo overfreezing de la suspensión (por ejemplo durante la centrifugación) no está permitido, especialmente si los estudios de transporte activo son muy importantes.
• Un parámetro importante es el tiempo de duración del procedimiento, el aislamiento debe ser realizado lo más rápidamente posible y la preparación obtenida debe ser utilizado inmediatamente. Por lo tanto, instrumentos quirúrgicos, soluciones y aparatos tienen que estar preparados de antemano.

Materiales e instrumentos

Instrumentos

1. Tijeras rectas de operación, el punto fuerte
2. Tijeras curvas
3. Fórceps
4. Una caja de petri
5. Pequeño embudo + pedazo de nylon filtro (previamente lavada)
6. 6 vasos de 50 ml
7. Dos agitadores magnéticos y dos baños de hielo
8. Un gran baño de hielo
9. Dos barras magnéticas pequeñas
10. Espátulas para raspar pellet
11. Tubos de centrífuga
12. Prensa Latapie tejido (se puede sustituir con prensa de ajo)
13. Teflón-vidrio de 20 ml y homogeneizadores de un 2 ml-
14. Residuos vaso
15. Tubos Eppendorf de suspensión definitiva mitocondrial y muestras para la determinación de proteínas
16. Baños de hielo

Soluciones (calculado por 2 ratas):

1. Tampón de lavado: 0,3 M de sacarosa, 10 mM HEPES (pH = 7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml)
2. Aislamiento de amortiguación: 0,3 M de sacarosa, 10 mM HEPES (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml de BSA (Sigma A6003) (preparado a partir de la solución de lavado 100 ml). Albúmina sérica bovina puede ser sustituidos por otros menos caros de ácidos grasos libres análogos. El mismo tampón, o sus variantes isotónicas se puede utilizar como buffer de resuspensión.
3. Tripsina (Sigma T8003): Se 2.5mg/ml en 1 mM HCl (0,5 ml)
4. Inhibidor de tripsina de soja (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml de solución tampón de aislamiento

Protocolo

El esquema general del procedimiento se muestra en la figura. 1. Corazones deben ser enfriados y lavados en tampón de lavado, el tejido extirpado ventricular, picada y homogeneizada durante el tratamiento con tripsina fotolítica. La suspensión se centrifuga a baja velocidad y el sobrenadante obtenido se centrifugó de nuevo a una velocidad más alta para recoger las mitocondrias. En función de los experimentos previstos el buffer resuspensión puede ser sustituida por cualquier otra solución isotónica.

Los animales fueron terminados de acuerdo con el Reino Unido "Animals (Scientific Procedures) Act". por dislocación cervical seguido por decapitación. Es necesario extraer el corazón inmediatamente después de la decapitación del animal, de modo que no hay retraso entre la terminación de los animales y la extracción de corazón. Si el aislamiento paralelo de mitocondrias de hígado se espera que las ratas deben estar en ayunas durante la noche antes del experimento.

1. Preparar tres vasos de precipitado que contiene 40 ml de Tampón de Lavado. Enfriar en un baño de hielo y sal de 3 a 5 min antes de proceder al siguiente paso. Asegúrese de que no los overfreeze y utilizar inmediatamente justo después de las nubes de cristales de hielo comienzan a aparecer.
2. Abrir el tórax de la rata decapitado y extraer el corazón. Hacen pequeñas incisiones y luego transferir inmediatamente el corazón a la solución enfriada con hielo en el vaso de primera. Apriete el corazón para eliminar la sangre y la puso en el segundo vaso. Repita esta operación para cada corazón.
3. Seca el corazón en el papel de filtro. Eliminar todas las grasas en la sangre, coagulada, aurículas y la fascia y la piscina del tejido ventricular.
4. Picar el tejido combinado con pequeñas tijeras curvas en la placa de Petri en el hielo durante unos 5 minutos hasta que el tamaño de las partículas es de unos 1-2 mm.
5. Coloque el tejido picado en la prensa del tejido y pasartravés de él. Tenga en cuenta que una cantidad sustancial de material puede permanecer en la prensa para recoger todos los tejidos del corazón de las paredes y el fondo de la prensa.
6. Transferir el material en el vaso con 50 ml de Tampón de Lavado y revuelva. Después se filtra la suspensión a través de un filtro de nylon. Lave el tejido picado en el filtro 3 veces con el tampón de lavado y descartar el filtrado.
7. La transferencia de los tejidos lavados en 20 ml de tampón de lavado y colocarlo en el baño de hielo en el agitador magnético. Añadir 0,5 ml de solución de tripsina con agitación constante y en marcha el temporizador. Se prepara otro agitador magnético, baño de hielo y un segundo vaso de 50 ml.
8. En el ^minuto 4 brevemente homogeneizar la parte de suspensión por parte de utilizar una pequeña muy ajustada de vidrio Teflón homogeneizador (10 y 15 ml) con varios golpes arriba y abajo para dispersar a la suspensión. Después de la homogeneización de transferencia de la suspensión en el segundo vaso. Repita el procedimiento en el minuto 9 ^º, por lo que se realiza la homogeneización de la suspensión de dos veces en total. Después de 15 minutos de incubación, agregar 10 ml de aislamiento de un tampón que contiene inhibidores de la tripsina y se incuba durante 1 min.
9. Filtrar la suspensión una vez más a través de un filtro de nylon y guardar el líquido filtrado. Recoger la fracción de partículas a la izquierda en un filtro y se homogeneiza durante 1 minuto en 15-20 ml de tampón de lavado.
10. Combine el homogeneizado con el filtrado y centrifugado durante 15 minutos a 600g.
11. Cuidadosamente filtra el sobrenadante resultante en un tubo de centrífuga de nuevo. Evitar la contaminación por el sedimento y se centrifuga de nuevo durante 15 min a 8500g.
12. Después de la centrifugación de alta velocidad descartar el sobrenadante y lavar el pellet 2-3 veces con 1 ml de buffer de descartar la mullida capa blanca del borde exterior. Romper la pastilla con la espátula, sino evitar la mancha roja de los eritrocitos en la parte inferior. Si las células sanguíneas se loos, eliminar los bits de color rojo de la suspensión antes de la homogeneización.
13. Resuspender el precipitado con un homogeneizador de pequeñas o bien mediante pipeteo suave. Diluir la suspensión con más Isolationbuffer y centrifugar de nuevo durante 15 min a 8500g.
14. Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado en la resuspensión de búfer (un tampón isotónico de elección) y se centrifuga de nuevo.
15. El marrón resultante pastilla contiene lavado mitocondrias intactas. Resuspender el precipitado en un volumen muy pequeño de tampón isotónico de su elección.

Figura 1. Esquema que demuestra el procedimiento paso a paso de aislamiento de las mitocondrias de corazón de rata. Parte superior, Etapas 1-9: alteración del tejido, el tratamiento de la tripsina y la homogeneización; parte inferior, las etapas 10-15: centrifugación diferencial.

Discussion

Protocolo detallado rápido para el aislamiento de las mitocondrias intactas con un alto grado de acoplamiento se describe. La preparación obtenida puede ser utilizada para la investigación funcional o estructural de la bioenergética celular, estudios de proteómica o análisis de ADN mitocondrial y el contenido de lípidos. Estudios biofísicos del transporte activo de iones y los intermediarios metabólicos también se puede realizar. Es posible que otro proceso de la preparación mitocondrial con el fin de aislar partículas submitocondriales, la membrana externa o purificar los componentes separados de la fosforilación oxidativa. El método descrito es una modificación del protocolo estándar de aislamiento por Jacobus y Saks ^1. El rendimiento esperado de las mitocondrias preparado es de aproximadamente 10-15 mg de proteína mitocondrial por el corazón y la razón de control de la respiración en malato / glutamato de esta preparación varía entre 8 y 12 con respiración IV Estado de alrededor de 0,12 mmol O ₂ ^-1 proteína xmin XMG ^-1 a 23 ° C en el medio que comprende 0,25 M de sacarosa, 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mM fosfato de potasio (pH 8,0) con 150 mM de ADP para la iniciación de la respiración del Estado III (por las condiciones exactas experimental y adiciones, ver ref . ^2).

Se debe prestar especial atención a varios detalles técnicos antes del inicio del procedimiento de aislamiento. Es crucial para el uso limpio tubos de policarbonato o polipropileno centrífuga, por lo tanto, los tubos deben lavarse con un cepillo limpio y agua caliente, sin embargo, el tratamiento con detergente debe mantenerse al mínimo. Además, es conveniente recoger toda la cristalería y los instrumentos necesarios en la cámara fría un día antes del aislamiento.

Durante el aislamiento, cuando la transferencia de buffers de los frascos de vasos, la atención а debe prestarse especial atención para evitar que las gotas de agua helada en las soluciones. Al manipular los tejidos hay que destacar que la extracción del corazón deben llevarse a cabo tan pronto como sea posible, ya que incluso a corto tiempo de retardo entre la decapitación del animal y el enfriamiento del tejido se traduciría en las mitocondrias parcialmente desacoplada. El enfriamiento rápido y un lavado profundo de los corazones eliminado es esencial para obtener la preparación estándar, libre de hemoglobina y eritrocitos NADase.

Tripsina se utiliza para la degradación de las proteínas conectivo para aumentar la susceptibilidad del tejido a fuerza de corte durante la homogeneización. La exposición prolongada de los tejidos de la proteasa se debe evitar, ya que los resultados en las mitocondrias de calidad inferior.

Después de centrifugaciones a alta velocidad de las paredes de los tubos de centrifugación deben limpiarse con un pañuelo de papel para eliminar los depósitos de material de grasa acumulada en las paredes.

Para la resuspensión final es mejor utilizar un volumen bajo de la amortiguación final con el fin de minimizar la pérdida de las funciones mitocondriales durante el almacenamiento (150 a 200 l de tampón por el corazón). Para los estudios de transporte de cationes bivalentes no agentes quelantes deben estar presentes en la preparación final de lo que las mitocondrias se deben lavar varias veces con EGTA medio libre y utilizado en las primeras horas después de su aislamiento.