Summary
हम शुद्ध, उच्च मिलकर चूहे सेलुलर bioenergetics, biophysical माप, प्रोटिओमिक्स या mitochondrial डीएनए और lipids विश्लेषण कार्यात्मक या संरचनात्मक अध्ययन के लिए mitochondria दिल के अलगाव के लिए а प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
सेलुलर एटीपी oxidative phosphorylation की प्रक्रिया में पीढ़ी में mitochondria के समारोह में व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है. पिछले कुछ दशकों के दौरान ऊर्जा की पीढ़ी की तुलना में अन्य mitochondria के कार्यों की हमारी समझ में उल्लेखनीय प्रगति की गई है. ये apoptosis में उनकी भूमिका में शामिल हैं, organelles, स्तनधारी विकास संकेतन और सेल चयापचय और सेल प्रसार के बीच समन्वय के लिए उनके योगदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उम्र बढ़ने के रूप में अभिनय. Mitochondria द्वारा संग्राहक जैविक प्रक्रियाओं की हमारी समझ अलगाव और प्रयोगशाला पशुओं के ऊतकों से बरकरार mitochondria की हैंडलिंग के लिए मजबूत तरीके पर आधारित है. चूहे दिल से Mitochondria बाहर दस्तक जानवरों पर अध्ययन सहित सेलुलर चयापचय के अतीत और वर्तमान के अध्ययन के लिए सबसे आम की तैयारी की है.
यहाँ हम युग्मन के एक उच्च डिग्री के साथ बरकरार mitochondria की अलगाव के लिए एक विस्तृत तेजी से विधि का वर्णन करता है. चूहे mitochondria दिल की इस तरह की तैयारी सेलुलर bioenergetics, biomolecules, प्रोटिओमिक अध्ययन mitochondrial डीएनए, प्रोटीन और lipids और विश्लेषण के परिवहन पर कार्यात्मक और संरचनात्मक अनुसंधान के लिए एक उत्कृष्ट वस्तु है.
Protocol
परिचय
चूहे दिल से Mitochondria सेलुलर चयापचय के अतीत और वर्तमान के अध्ययन के लिए सबसे आम की तैयारी की है. वे बड़ी मात्रा में जल्दी और मज़बूती से कर सकते हैं जंगली प्रकार या दस्तक - बाहर पशुओं से प्राप्त है. सामान्य प्रक्रिया trypsin fractionation, और अंतर centrifugation द्वारा ऊतक पाचन के होते हैं.
वहाँ कई स्थितियों है कि mitochondria के अलगाव के दौरान दिल (1 छवि) सहित विभिन्न ऊतकों से रखा हो रहे हैं.
- ऊतक अच्छी तरह से, कीमा बनाया हुआ हो सकता है क्योंकि यह सीधे प्राप्त mitochondria की उपज को प्रभावित करता है. हृदय के ऊतकों का सबसे अच्छा है छोटे घुमावदार कैंची के साथ कीमा और एक Latapie ऊतक चक्की उपयोग द्वारा पीछा किया जा सकता है है, या यदि एक ऊतक बनाने की मशीन उपलब्ध है, आउटलेट के आसपास 1.0 मिमी व्यास के छेद व्यास के साथ एक लहसुन प्रेस नहीं है.
- यह हर कदम पर समाधान के तापमान को बनाए रखने के लिए आवश्यक है. इसलिए पूरी प्रक्रिया के लिए एक ठंडे कमरे और सभी उपकरणों में किया जाता है और समाधान करने के लिए तैयार रहना चाहिए और अग्रिम में ठंडा है. यदि तापमान की स्थिति नहीं रखा जाता है की तैयारी के स्थिर कई गुण खो जा सकता है. Mitochondrial संरचना बहुत तो निलंबन की overfreezing (centrifugation के दौरान उदाहरण के लिए) की अनुमति नहीं है, खासकर अगर सक्रिय परिवहन के अध्ययन महत्वपूर्ण हैं ठंड संवेदनशील है.
- एक महत्वपूर्ण पैरामीटर प्रक्रिया के समय की लंबाई है, अलगाव के रूप में संभव के रूप में जल्दी से प्रदर्शन किया जाना चाहिए है और प्राप्त की तैयारी करने के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा है. इसलिए, शल्य चिकित्सा उपकरण, समाधान और उपकरणों के लिए अग्रिम में तैयार रहना होगा.
सामग्री और उपकरणों
उपकरण
- सीधे ऑपरेटिंग कैंची, तेज बिंदु
- घुमावदार कैंची
- चिमटा
- पेट्री डिश
- लघु + कीप नायलॉन फिल्टर का टुकड़ा (prewashed)
- 6 50 मिलीलीटर beakers
- दो चुंबकीय stirrers और दो बर्फ स्नान
- एक बड़ा बर्फ स्नान
- 2 छोटे चुंबकीय सलाखों
- गोली के लिए Spatulas scraping
- अपकेंद्रित्र ट्यूबों
- Latapie ऊतक प्रेस (लहसुन प्रेस के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है)
- Teflon गिलास 20ml होमोजेनाइजर्स और 1-2ml
- अपशिष्ट बीकर
- अंतिम mitochondrial प्रोटीन निर्धारण के लिए निलंबन और नमूने के लिए Eppendorf ट्यूबों
- बर्फ स्नान
समाधान (2 चूहों प्रति गणना):
- वॉशिंग बफर: 0.3 एम Sucrose, 10 मिमी HEPES (पीएच 7.2 =), 0.2 मिमी EDTA (1000 मिलीलीटर)
- अलगाव बफर: 0.3 एम Sucrose, 10 मिमी HEPES (= पीएच 7.4), 0.2 मिमी EDTA, 1 मिलीग्राम / एमएल (A6003 सिग्मा) BSA (100ml धुलाई बफर से तैयार). गोजातीय सीरम albumin कम खर्चीला फैटी एसिड मुक्त analogues द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है. एक ही बफर या उसके isotonic विविधताओं बफर Resuspending के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- Trypsin समाधान (सिग्मा T8003) 1mm एचसीएल में 2.5mg/ml (0.5 मिलीलीटर)
- सोया से trypsin अवरोध करनेवाला (T9128 सिग्मा) 6.5 अलगाव बफर के mg/10 मिलीलीटर
प्रोटोकॉल
प्रक्रिया की सामान्य योजना छवि पर दिखाया है. 1. दिल और ठंडा होना चाहिए धुलाई बफर, निलय ऊतक excised, कीमा बनाया हुआ है और trypsin के साथ photolytic इलाज के दौरान homogenised में धोया. निलंबन कम गति पर centrifuged है और फिर से प्राप्त की सतह पर तैरनेवाला उच्च गति पर centrifuged है mitochondria इकट्ठा. योजना बनाई प्रयोगों के आधार पर resuspending बफर किसी अन्य isotonic समाधान द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
पशु अनुसार ब्रिटेन के साथ समाप्त किया गया "(वैज्ञानिक प्रक्रिया) पशु अधिनियम." गर्भाशय ग्रीवा के कत्ल द्वारा पीछा अव्यवस्था के द्वारा. यह जानवर के कत्ल के बाद तुरंत निकालने के दिल करने के लिए आवश्यक है, इसलिए है कि वहाँ जानवरों की समाप्ति और हृदय निष्कर्षण के बीच कोई देरी है. यदि mitochondria जिगर के समानांतर अलगाव की उम्मीद है चूहों प्रयोग करने के लिए पहले रात भर उपवास करना चाहिए.
- तीन बफर धोने के 40 मिलीलीटर युक्त beakers तैयार. उन्हें अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले 3 से 5 मिनट के लिए बर्फ नमक स्नान में अच्छा है. उन्हें नहीं overfreeze और तुरंत का उपयोग बस के बाद बर्फ क्रिस्टल के बादलों को दिखाई शुरू करने के लिए सुनिश्चित करें.
- Decapitated चूहे की छाती खोलें और दिल निकालने. छोटे चीरों बनाओ और फिर तुरंत पहले बीकर में ठंडा समाधान के लिए दिल हस्तांतरण. हृदय के लिए रक्त को हटा दें और इसे दूसरे बीकर में डाल दबाओ. हर दिल के लिए दोहराएँ इस आपरेशन.
- फिल्टर पेपर पर दिलों सूखी. सभी वसा, पका हुआ, रक्त auricles और fasciae और पूल निलय ऊतक निकालें.
- लगभग 5 मिनट के लिए छोटे घुमावदार बर्फ पर पेट्री डिश पर कैंची के साथ जमा ऊतक कीमा तक कणों के आकार के बारे में 1-2 मिमी है.
- ऊतक प्रेस में कीमा बनाया हुआ ऊतक रखो और पासयह माध्यम से. पता है कि सामग्री का एक पर्याप्त राशि प्रेस में रहते हैं तो दीवारों और प्रेस के नीचे से सभी हृदय के ऊतकों को जमा कर सकते हैं.
- बीकर में 50 मिलीलीटर धुलाई बफर के साथ सामग्री और स्थानांतरण हलचल. फिर एक नायलॉन फिल्टर के माध्यम से निलंबन फिल्टर. फिल्टर 3 बार धुलाई बफर के साथ कीमा बनाया हुआ ऊतक और धो छानना त्यागें.
- स्थानांतरण धुलाई बफर के 20 मिलीलीटर में धोया ऊतक और यह चुंबकीय दोषी पर बर्फ स्नान में जगह. निरंतर क्रियाशीलता के तहत trypsin समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और टाइमर शुरू. दूसरे चुंबकीय उत्तेजक, बर्फ स्नान और एक दूसरे 50 मिलीलीटर बीकर तैयार.
- 4 वें मिनट में संक्षेप में कई और नीचे स्ट्रोक के साथ एक छोटा सा ढीला फिट गिलास Teflon homogeniser (10 15ml) का उपयोग करने के लिए निलंबन फैलाने के भाग के द्वारा निलंबन भाग homogenise. एकरूपता के दूसरे बीकर में निलंबन के बाद हस्तांतरण. 9 वें मिनट पर प्रक्रिया दोहराएँ, ताकि आप कुल में एकरूपता के निलंबन की दो बार प्रदर्शन . ऊष्मायन के 15 मिनट के बाद, बफर युक्त trypsin अवरोध करनेवाला को अलग करने के 10 मिलीलीटर जोड़ें और 1 मिनट के लिए सेते हैं.
- निलंबन फिर से एक नायलॉन फिल्टर के माध्यम से और फ़िल्टर छानना बचाने. कण धुलाई बफर के 15-20 मिलीलीटर में 1 मिनट के लिए एक फिल्टर और homogenise पर छोड़ दिया अंश लीजिए.
- Homogenate छानना और 600g पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के साथ जुडा है.
- ध्यान से एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब में जिसके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला फिल्टर. गोली के संक्रमण से बचें और 8500g पर 15 मिनट के लिए फिर से अपकेंद्रित्र.
- उच्च गति centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला त्यागने और बफर discarding के भुलक्कड़ सफेद बाहरी रिम परत 1 मिलीलीटर के साथ गोली 2-3 बार कुल्ला करें. रंग के साथ गोली तोड़ लेकिन एरिथ्रोसाइट्स के तल पर लाल जगह से बचने. यदि रक्त कोशिकाओं घरों में शौचालय मिला, एकरूपता पहले निलंबन से लाल बिट को हटा दें.
- गोली के साथ एक छोटा सा या कोमल pipetting द्वारा वैकल्पिक homogeniser Resuspend. अधिक Isolationbuffer के साथ निलंबन पतला और 8500g पर 15 मिनट के लिए फिर से अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें, बफर (पसंद का एक isotonic बफर) Resuspending में गोली resuspend और फिर अपकेंद्रित्र.
- परिणामस्वरूप भूरे रंग गोली धोया बरकरार mitochondria शामिल हैं. अपनी पसंद के isotonic बफर के एक बहुत छोटी मात्रा में गोली Resuspend.
चित्रा 1 चूहे mitochondria दिल के अलगाव के कदम प्रक्रिया द्वारा कदम का प्रदर्शन योजना. शीर्ष भाग, 1-9 चरणों: ऊतकों के विघटन, trypsin उपचार और एकरूपता, नीचे के भाग, चरणों 10-15: अंतर centrifugation.
Discussion
युग्मन के एक उच्च डिग्री के साथ बरकरार mitochondria के अलगाव के लिए विस्तृत तेजी प्रोटोकॉल में वर्णित है. प्राप्त तैयारी सेलुलर bioenergetics, प्रोटिओमिक अध्ययन या mitochondrial डीएनए और लिपिड सामग्री का विश्लेषण कार्यात्मक या संरचनात्मक अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आयनों और चयापचय मध्यवर्ती की सक्रिय परिवहन के biophysical का अध्ययन भी किया जा सकता है. यह संभव है करने के लिए आगे mitochondrial तैयार करने की प्रक्रिया के क्रम में submitochondrial कण, बाहरी झिल्ली या oxidative phosphorylation के शुद्ध अलग घटकों को अलग. वर्णित विधि Jacobus और एक Saks द्वारा अलगाव की मानक प्रोटोकॉल का एक संशोधन है. तैयार mitochondria की उम्मीद की उपज दिल प्रति mitochondrial प्रोटीन और Malate / ग्लूटामेट ऐसी तैयारी के बीच बदलता है पर सांस नियंत्रण अनुपात लगभग 10-15 मिलीग्राम है 8 से 12 μmol हे 0.12 के आसपास 2 xmin -1 xmg प्रोटीन के राज्य चतुर्थ श्वसन के साथ -1 23 ° सी 0.25 एम sucrose, 10 मिमी KCl, 0.2 मिमी EDTA, दीक्षा राज्य III श्वसन के लिए 150 सुक्ष्ममापी ADP (सटीक प्रयोगात्मक शर्तों और परिवर्धन के लिए, रेफरी देख के साथ 5 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट (पीएच 8.0) शामिल मध्यम में 2.).
विशेष ध्यान अलगाव प्रक्रिया के शुरू करने से पहले कई तकनीकी जानकारी दी जानी चाहिए. यह साफ polycarbonate या polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूबों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए ट्यूब अच्छी तरह से एक साफ ब्रश और गर्म पानी, लेकिन डिटर्जेंट उपचार न्यूनतम पर रखा जाना चाहिए के साथ धोया जाना चाहिए. इसके अलावा, यह बेहतर है ठंडे कमरे में सभी आवश्यक कांच के बने पदार्थ और उपकरणों के अलगाव के एक दिन पहले एकत्र.
अलगाव के दौरान जब बोतल से beakers के लिए स्थानांतरित बफ़र्स, а विशेष ध्यान के समाधान में बर्फ के पानी की बूंदों को रोकने के लिए दिया जाना चाहिए. जब ऊतकों से निपटने यह जोर दिया जाना चाहिए कि दिल निष्कर्षण बाहर किया जाना चाहिए भी जानवर के कत्ल और ठंडा ऊतक के बीच कम समय देरी आंशिक रूप से uncoupled mitochondria में नतीजा होगा के बाद से जितनी जल्दी हो सके. रैपिड ठंडा और हटाया दिलों की पूरी तरह से धोने के लिए मानक तैयारी, हीमोग्लोबिन और एरिथ्रोसाइट NADase से मुक्त प्राप्त करने के लिए आवश्यक है.
Trypsin संयोजी प्रोटीन गिरावट के लिए प्रयोग किया जाता है कर्तन बल एकरूपता दौरान ऊतक की संवेदनशीलता में वृद्धि. ऊतक के लम्बे समय तक protease के लिए जोखिम के बाद से यह निम्न गुणवत्ता के mitochondria में परिणाम से बचा जाना चाहिए.
अपकेंद्रित्र ट्यूबों के उच्च गति centrifugations के बाद दीवारों टिशू पेपर के साथ नष्ट किया जाना चाहिए दीवारों पर जमा वसा सामग्री के किसी भी जमा हटा.
अंतिम resuspension के लिए यह करने के क्रम में अंतिम बफर के एक कम मात्रा का उपयोग भंडारण (दिल प्रति बफर के 150 से 200 μl) के दौरान mitochondrial कार्यों की हानि को कम से कम बेहतर है. द्विसंयोजक फैटायनों के परिवहन के अध्ययन के लिए कोई chelating एजेंट अंतिम तैयारी इस तरह के mitochondria में कई बार के लिए उपस्थित होना EGTA मुक्त मध्यम के साथ धोया जाना चाहिए और अलगाव के बाद पहली घंटे के भीतर इस्तेमाल होना चाहिए.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम लेखकों के परिचय के लिए mitochondrial जीव विज्ञान और इस प्रक्रिया में कई उपयोगी अंतर्दृष्टि और सलाह के क्षेत्र में प्रो ए Vinogradov और डॉ. वेरा Grivennikova धन्यवाद. लेखकों वीडियो तैयारी के साथ मदद के लिए क्वींस विश्वविद्यालय के मीडिया कार्यालय से श्रीमती अमांडा McKintock के लिए आभारी हैं.
References
- Jacobus, W. E., Saks, V. A. Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation. Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).
- Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria. Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).
