Preparazione del Cuore Rat altamente Accoppiato mitocondri

Summary

Descriviamo а protocollo per l'isolamento di puro cuore di ratto altamente accoppiato mitocondri per studi funzionali o strutturali di bioenergetica cellulare, misure biofisica, proteomica o il DNA mitocondriale e analisi di lipidi.

Abstract

La funzione dei mitocondri nella generazione di cellulari di ATP nel processo di fosforilazione ossidativa è ampiamente riconosciuto. Negli ultimi decenni ci sono stati significativi progressi nella nostra comprensione delle funzioni delle altre mitocondri rispetto alla generazione di energia. Questi includono il loro ruolo nella apoptosi, in qualità di segnalazione organelli, lo sviluppo e l'invecchiamento dei mammiferi e il loro contributo al coordinamento tra il metabolismo cellulare e la proliferazione cellulare. La nostra comprensione dei processi biologici modulata dai mitocondri si basa su metodi robusti per l'isolamento e trattamento dei mitocondri intatti dai tessuti degli animali da laboratorio. Mitocondri di cuore di ratto è una delle preparazioni più comuni per gli studi passati e presenti del metabolismo cellulare tra cui studi su animali knock-out.

Qui si descrive un metodo dettagliato per il rapido isolamento di mitocondri intatti con un alto grado di accoppiamento. Tale preparazione del cuore di ratto mitocondri è un oggetto ottimo per la ricerca funzionali e strutturali sulla bioenergetica cellulare, trasporto di biomolecole, studi di proteomica e analisi del DNA mitocondriale, proteine ​​e lipidi.

Protocol

Introduzione

Mitocondri di cuore di ratto è una delle preparazioni più comuni per gli studi passati e presenti del metabolismo cellulare. Essi possono essere ottenuti in modo rapido e affidabile in grande quantità dal tipo selvaggio o animali knock-out. La procedura generale consiste di digestione del tessuto dalla tripsina, il frazionamento e centrifugazione differenziale.

Ci sono diverse condizioni che devono essere tenuti in isolamento dei mitocondri da vari tessuti, compreso il cuore (Fig. 1).

• Il tessuto deve essere accuratamente tritata, in quanto influisce direttamente sulla produzione dei mitocondri ottenuti. Tessuto cardiaco è meglio tritare con piccole forbici curve e può essere seguita da utilizzare una smerigliatrice Latapie tessuto o, se un macinino tessuto non è disponibile, una pressa aglio con fori di diametro di uscita di circa 1,0 mm di diametro.
• E 'necessario mantenere la temperatura delle soluzioni ad ogni passo. Pertanto l'intera procedura deve essere effettuata in una stanza fredda e tutti gli strumenti e le soluzioni devono essere preparati e raffreddato in anticipo. Se le condizioni di temperatura non sono mantenuti stabili varie proprietà della preparazione può essere perso. Struttura mitocondriale è molto sensibile al gelo così overfreezing della sospensione (per esempio durante la centrifugazione) non è consentito, specialmente se gli studi di trasporto attivo sono importanti.
• Un parametro importante è il tempo-durata della procedura, l'isolamento deve essere eseguita il più rapidamente possibile e la preparazione ottenuto deve essere utilizzato immediatamente. Pertanto, strumenti chirurgici, le soluzioni e gli apparecchi devono essere preparati in anticipo.

Materiali e strumenti

Strumenti

1. Dritti forbici operativo, punta aguzza
2. Forbici curve
3. Forcipe
4. Scatola di Petri
5. Piccolo imbuto + pezzo di nylon filtro (lavata)
6. 6 bicchieri da 50 ml
7. Due agitatori magnetici e due bagni di ghiaccio
8. Un bagno di ghiaccio grande
9. 2 barre magnetiche piccoli
10. Spatole per raschiare pellet
11. Centrifuga tubi
12. Stampa del tessuto Latapie (può essere sostituito con stampa aglio)
13. Teflon-vetro omogeneizzatori 20ml e 1-2ml
14. Rifiuti coppa
15. Provette Eppendorf per la finale sospensione mitocondriale e campioni per la determinazione delle proteine
16. Bagni di ghiaccio

Le soluzioni (calcolato per 2 ratti):

1. Soluzione di lavaggio: 0,3 M saccarosio, 10 HEPES mM (pH = 7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml)
2. Isolamento tampone: 0,3 M saccarosio, 10 HEPES mM (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml di BSA (Sigma A6003) (preparato dal buffer di lavaggio 100 ml). BSA può essere sostituito da meno costosa grassi acidi analoghi. Lo stesso buffer o le sue variazioni isotonica può essere utilizzata come buffer di risospensione.
3. Tripsina (Sigma T8003) soluzione: 2.5mg/ml a 1 mM HCl (0,5 ml)
4. Tripsina inibitore di soia (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml di tampone di isolamento

Protocollo

Lo schema generale della procedura è riportato in fig. 1. Cuore deve essere raffreddato e lavato in tampone di lavaggio, il tessuto asportato ventricolare, tritato e omogeneizzato fotolitica durante il trattamento con tripsina. La sospensione è centrifugata a bassa velocità e il supernatante ottenuto viene centrifugato di nuovo alle alte velocità per raccogliere mitocondri. A seconda degli esperimenti previsti nel buffer risospendere può essere sostituito da qualsiasi altra soluzione isotonica.

Gli animali sono stati terminati in conformità con il Regno Unito "Animali (procedure scientifiche) Act". dalla dislocazione cervicale seguita da decapitazione. E 'necessario estrarre il cuore subito dopo la decapitazione dell'animale, in modo che non vi è alcun ritardo tra la fine degli animali e di estrazione del cuore. Se l'isolamento parallelo di fegato mitocondri si aspetta i ratti vanno lasciati a digiuno durante la notte prima dell'esperimento.

1. Preparare tre bicchieri contenenti 40 ml di tampone di lavaggio. Raffreddarli nel ghiaccio-sale da bagno da 3 a 5 minuti prima di procedere alla fase successiva. Assicurarsi di non overfreeze e utilizzare immediatamente subito dopo nuvole di cristalli di ghiaccio iniziano a comparire.
2. Aprire il torace del ratto decapitato ed estrarre il cuore. Fare piccole incisioni e poi subito a trasferire il cuore alla gelida soluzione nel becher prima. Spremere il cuore per rimuovere il sangue e lo mise nel secondo becher. Ripetere questa operazione per ogni cuore.
3. Secco il cuore sulla carta da filtro. Togliere tutto il grasso, sangue rappreso, orecchiette e fasce e la piscina del tessuto ventricolare.
4. Tritare il tessuto in pool con piccole forbici curve sul piatto di Petri in ghiaccio per circa 5 minuti fino a quando la dimensione delle particelle è di circa 1-2 mm.
5. Mettere il trito in tessuto la stampa dei tessuti e passareattraverso. Essere consapevoli del fatto che una notevole quantità di materiale può rimanere sulla stampa in modo da raccogliere tutto il tessuto cardiaco dalle pareti e fondo della stampa.
6. Trasferire il materiale nel becher con 50 ml di tampone di lavaggio e mescolate. Quindi filtrare la sospensione attraverso un filtro di nylon. Lavare il tessuto tritato sul filtro 3 volte con il tampone di lavaggio e scartare il filtrato.
7. Trasferire il tessuto lavato in 20 ml di tampone di lavaggio e posizionarlo nel bagno di ghiaccio sul agitatore magnetico. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di tripsina sotto agitazione costante e avviare il timer. Preparare un altro agitatore magnetico, bagno di ghiaccio e un secondo 50 bicchiere ml.
8. Sul 4 ^° minuto brevemente omogeneizzare la porzione sospensione da parte con un piccolo vagamente dotato di vetro teflon omogeneizzatore (10-15ml) con diversi colpi su e giù per disperdere la sospensione. Dopo omogeneizzazione trasferire la sospensione nel becher secondo. Ripetere la procedura per il 9 ^° minuto, in modo da eseguire l'omogeneizzazione della sospensione due volte in totale. Dopo 15 min di incubazione, aggiungere 10 ml di isolare tampone contenente inibitori della tripsina e incubare per 1 min.
9. Filtrare la sospensione di nuovo attraverso un filtro di nylon e salvare il filtrato. Raccogliere la frazione di particolato a sinistra su un filtro e omogeneizzare per 1 min a 15-20 ml di tampone di lavaggio.
10. Combina l'omogeneizzato con il filtrato e centrifugare per 15 minuti a 600g.
11. Con attenzione filtrare il supernatante risultante in una provetta da centrifuga nuovo. Evitare la contaminazione del pellet e centrifugare ancora per 15 minuti a 8500g.
12. Dopo la centrifugazione ad alta velocità scartare il surnatante e lavare il pellet di 2-3 volte con 1 ml di buffer di scartare il soffice strato bianco bordo esterno. Spezzare il pellet con la spatola, ma evitare la macchia rossa di eritrociti in basso. Se le cellule del sangue ottenuto Loos, rimuovere i bit rossi dalla sospensione prima di omogeneizzazione.
13. Risospendere il pellet con un piccolo omogeneizzatore o, in alternativa pipettando gentile. Diluire la sospensione con più Isolationbuffer e centrifugare ancora per 15 minuti a 8500g.
14. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in risospensione tampone (un buffer isotonica di scelta) e centrifugare di nuovo.
15. La risultante marrone pellet contiene lavato mitocondri intatti. Risospendere il pellet in un volume molto piccolo di tampone isotonica di vostra scelta.

Figura 1. Schema dimostrando la procedura passo-passo di isolamento del cuore di ratto mitocondri. Parte superiore, Fasi 1-9: disgregazione del tessuto, il trattamento tripsina e omogeneizzazione; parte inferiore, tappe 10-15: centrifugazione differenziale.

Discussion

Dettagliato protocollo rapido per l'isolamento dei mitocondri intatti con un alto grado di accoppiamento è descritto. Preparato ottenuto può essere utilizzato per la ricerca funzionale o strutturale bioenergetica cellulare, studi di proteomica o analisi del DNA mitocondriale e contenuto di lipidi. Studi biofisici di trasporto attivo di ioni e metaboliti intermedi può essere eseguita anche. E 'possibile elaborare ulteriormente la preparazione mitocondriale al fine di isolare particelle submitocondriali, membrana esterna o purificare componenti separati della fosforilazione ossidativa. Il metodo descritto è una modifica del protocollo standard di isolamento da Jacobus e Saks ^1. Il rendimento atteso dei mitocondri preparato è di circa 10-15 mg di proteine ​​mitocondriali per cuore e il rapporto di controllo respiratorio sul malato / glutammato di tale preparazione varia da 8 a 12 con la respirazione Stato IV di circa 0,12 mmol O ₂ proteine ​​xmin ^-1 XMG ^-1 a 23 ° C nel medio composto da saccarosio 0,25 M, 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mM fosfato di potassio (pH 8,0) con 150 ADP mM per la respirazione iniziazione Stato III (per le esatte condizioni sperimentali ed integrazioni, vedi rif . ^2).

Particolare attenzione dovrebbe essere data ad alcuni dettagli tecnici prima dell'inizio della procedura di isolamento. E 'fondamentale utilizzare pulire in policarbonato o provette da centrifuga in polipropilene, quindi i tubi devono essere accuratamente lavati con un pennello pulito e acqua calda, tuttavia il trattamento detergente deve essere mantenuto al minimo. Inoltre, è meglio per raccogliere tutta la vetreria e gli strumenti necessari nella stanza fredda un giorno prima l'isolamento.

Durante l'isolamento durante il trasferimento dal buffer di palloni bicchieri, а attenzione particolare deve essere posta per evitare che gocce d'acqua ghiacciata nelle soluzioni. Durante la manipolazione dei tessuti è opportuno sottolineare che l'estrazione cuore deve essere effettuata nel più breve tempo possibile, dal momento che anche a breve tempo di ritardo tra la decapitazione dell'animale e il raffreddamento del tessuto si tradurrebbe in mitocondri parzialmente disaccoppiato. Rapido raffreddamento e lavaggio accurato dei cuori rimosso è essenziale per ottenere la preparazione standard, privo di emoglobina e NADase eritrociti.

Tripsina viene utilizzato per connettivo degradazione delle proteine ​​per aumentare la suscettibilità del tessuto per forza di taglio durante l'omogeneizzazione. L'esposizione prolungata del tessuto della proteasi deve essere evitata in quanto si traduce in mitocondri di qualità inferiore.

Dopo centrifugazioni ad alta velocità le mura del provette devono essere pulite con la carta velina per rimuovere eventuali depositi di materiale grasso accumulato sulle pareti.

Per la risospensione finale è meglio utilizzare un basso volume del buffer finale al fine di minimizzare la perdita di funzioni mitocondriali durante lo stoccaggio (da 150 a 200 ul di buffer per ogni cuore). Per gli studi del trasporto di cationi bivalenti non agenti chelanti devono essere presenti nella preparazione finale così mitocondri devono essere lavati più volte con EGTA-free medio e utilizzato entro prime ore dopo l'isolamento.