Summary
我们将演示前的小分子RNA的设置和分析QPCR 96孔阵列以及使用机器人手用Thermo Scientific的矩阵多道移液器。
Abstract
实时定量PCR（QPCR）已成为一个准确和有价值的工具，在分析基因表达水平。它的诸多优点之一，是一个较低的检测限相比，基因表达分析等方法，同时使用，每个检测数额较小的输入。自动定量PCR安装更大的可重复性，从而改善了这一领域。它的方便和快速设置允许用于高通量实验，使许多不同的基因分析，同时在每个实验。这连同内部板控制的方法，也降低了其他技术的共同实验变量。我们最近开发的一个前小分子RNA分析的定量PCR检测（前- miRNA的），使用186个引物对。小分子RNA已成为一类新的小，非编码RNA的调节能力，在许多基因的转录后水平的目标。作为一个主要的miRNA（PRI - miRNA）的成绩单，然后到前体miRNA（预miRNA）的切割，这些小分子RNA是由RNA聚合酶Ⅱ转录。预miRNA是出口到细胞质中Dicer酶切割产生成熟的miRNA发夹环。在miRNA水平的提高，可以观察到的前体和成熟的miRNA的水平都和这两种形式分析是有用的。有几种市售成熟的miRNA的检测，但其成本高，可能会阻止从这个分析技术的研究人员。在这里，我们讨论了一个具有成本效益，可靠的分析前的miRNA，基于SYBR的qPCR的方法。 miRNA的前水平的变化往往反映了成熟miRNA的变化和成熟的miRNA的表达可以是一个有用的指标。然而，同时分析前的miRNA和成熟的miRNA可能是最佳的，因为他们可以作出贡献的非冗余信息，并提供处理成小分子RNA的见解。此外，这里描述的技术可以扩展，包括具体途径或病原体的其他库集的分析。
Protocol
qPCR的预miRNA表达谱阵列，可以成立一个特餐自由埃沃机器人（A）或手与基体的电子多道移液器（二）充分自动化。
1）准备主结构，引板和样品。
- 底漆板含有186个引物对96孔板格式在下午12时05分（共2板），应储存在-80 ° C解冻板在室温下，旋涡和离心机使用前简要。
- 要准备的主结构，SYBR绿色2X PCR混合物在室温下解冻。每个反应使用2ul底漆8ul预混。每个反应的主结构的组成是4UL SYBR组合，3ul PCR级水和10-20吴样本DNA或cDNA。
- 每96底漆板的设置，四大高手混合管是必要的。样品可以运行4个样本（singlicate）每盘，每盘2个样本（复印件）或单个样品一式四份。
- 准备42毫升Eppendorf管相结合的SYBR，水和样品的主结构。每个管应包含足够的预混约100反应，让多余的废物吹打。涡旋混合。
A.安装前的miRNA使用自由特餐埃沃机器人的实验。
- 机器人和加载的Evoware程序初始化后，30mls每个冲洗三次，以清除气泡会干扰移液精度系统。
- 安装的机器人平台，包括以下内容：
- 标记384孔板
- 96孔引物板（1）
- 主混音
- 含有2％的漂白粉低谷
- 一个充满制度液容器
- 空废物容器
- 首先，选择“运行”两次自动机器人运行。
- 在节目结束时，删除的LightCycler 480密封箔384孔板和密封，并短暂离心。酒店的位置1处密封384孔板。
- 转到步骤2.2和底漆板2，与新的主混合和一个新的384孔板的重复。
- 密封板放置在酒店的位置2。
- 打开新Evoware程序加载从酒店在LightCycler，并选择“运行”两次。
- 自由埃沃将自动加载到每个板块的LightCycler，并运行以下的SYBR绿色的I /人力资源管理循环程序：
前（1个周期）：
50 ° 5分钟斜率4.8 ° /秒
95 ° 5分钟斜率4.8 ° /秒
放大器（45个循环）：
15秒95 °斜率4.8 ° /秒
30秒62 °斜率2.5 ° /秒
（在此步骤中的单个数据采集）
熔点曲线：
5秒，95 °斜率4.8 ° /秒
60℃1分钟斜率2.5 ° /秒
95 °持续升温速率为0.11 ° /秒
5收购每° C
酷：
30秒50 °斜率25 ° /秒
- 自由埃沃将自动加载到每个板块的LightCycler，并运行以下的SYBR绿色的I /人力资源管理循环程序：
B.安装前miRNA的检测使用矩阵电子多道移液器：
- 预混1到水库管放置的内容。
- 设置电子移液器吸16ul 2 - 8ul预混免除吹扫步骤遵循的步骤。
- 对于预混1，分配到每一个其他的384孔板（384孔尖间距设置）以及8ul，孔A1开始。 （即孔A1，C1，E1等），对于第二8ul免除，移动到第3列（即井A3，C3，E3，等），然后通过一个废物容器的清除和处理技巧。
- 其余5个周期，按照这种模式，直到您到达以及A23。
- 重复的master mix 2，（开头以及A2，C2，E2，等等）;预混3（孔B1，D1，F1等开始）;预混4（开始在B2，D2，F2键等。）
- 对于引物板aliquotting，设置电子移液器吸2ul并免除2ul与清除步骤如下。到384孔板，孔A1，C1，E1等在一个废物容器的清除和处理技巧，免除从96孔底漆板（AH）的第1列的引物2ul。重复井A2，C2，E2，B1，D1，F1;和B2，D2，F2键等。
- 重复2-12行96引物，引物各列，每2列移动，直到全部384孔板已aliquotted。
- 与LightCycler配套的密封铝箔和离心密封板。
- 进入一个的LightCycler 480和周期的板块，按照以下设置使用SYBR GREEN I /人力资源管理检测格式板：
前（1个周期）：
50 ° 5分钟斜率4.8 ° /秒
95 ° 5分钟斜率4.8 ° /秒
安培（45个循环）：
在升温速率为15秒95 °4.8 ° /秒
30秒62 °斜率2.5 ° /秒
（在此步骤中的单个数据采集）
熔点曲线：
5秒95 °斜率4.8 ° /秒
60℃1分钟斜率2.5 ° /秒
95 °持续升温速率为0.11 ° /秒
5收购每° C
酷：
30秒50 °斜率25 ° /秒 - 重复使用底漆板2，使用新鲜配制的主混合到一个新的384盘aliquotting。
成功秘诀：
设计PCR扩增阵列时的一个重要特点是，所有186个引物对具有相同的退火温度，使板可运行在同样的最佳PCR运行的程序设置。
使用三个控件在运行样品前，应检查每一个新的数组。这些控制包括：
1运行与运行，以排除引物污染的水或0.1 x TE所有引物。
运行交替水/ TE和阳性对照，以确保无交叉污染。
3运行使用相同的阳性对照，以确保运行之间的可重复性。
主混音应新鲜配制，板应在24小时内运行，以获得最佳效果
应去除引物板箔，慢慢井间的污染，以减少风险。
在使用机器人与固定提示时，2％的漂白粉洗，洗彼此之间移液步骤的提示，通过用水冲洗是必要的。这样可以防止和消除结转，否则可能污染数据，导致不确定的结果。
后板是通过在LightCycler上运行，它不应该再次被打开的PCR设置房间。这有助于防止污染的PCR。
代表性的成果：
qPCR的结果通常是代表在LightCycler分析软件确定CT值。通常包括积极为样本，样品，通常介于20-35的CT范围的成功运行。水样在一个良好的运行总是在> 40 CT和任何样品或与CT的具体井超过37被认为是负面的，或者未检出。作为一般规则，样品产生<10 CT也是不可靠的，从进一步的分析排除。有几种方法，来分析我们的检测的qPCR数据和内部控制纳入有助于控制样本输入的变化。预MIR阵列包括一个U6对照引物，这往往是用来作为参考基因正常化从不同样品的CT值。这被称为三角洲CT值（DCT）的标准化值。结果往往是绘制为原料的CT，DCT值或标准值可进一步分析。
在图1中的全部四个不同的样品从timecourse实验前的microRNA阵列分析热图格式。每个前的小分子RNA的相对表达显示，并出现了三大鲜明的集群。大多数的分析预大鹏进行了小的，微不足道的变化，如预期（图1A）。然而，前的小分子RNA的一小部分有显着下降（图1B）或整个timecourse实验的急剧增加（图1C）。 0H时间点（样品1）作为基线水平的每一个预选的microRNA的表达水平正常化。在某些情况下，您可能会注意到，一些聚集前的microRNA也集中在热图分析（例如：让7A，图1B）。根据实验，集群可能出现依赖于病毒感染的细胞类型前的小分子RNA或预大鹏的具体体现，是一个共同的分子信号转导通路调节。
我们也已经开发出包括前的小分子RNA检测已知病毒前- microRNA和卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）和EB病毒（EBV）的除人类预大鹏编码基因的数量。这些可以被用来作为积极或消极的控制，取决于细胞株和所使用的样本的病毒状态。在图2中，一式四份运行KSHV的阴性样品平均的CT所示。重要的是，KSHV的LANA没有检测到在此示例中高度敏感的qPCR阵列。然而，U6 - 我国企业内部控制和let - 7A - 一个高度表达的人类前小分子RNA，表示检测不到的水平。最后，正如所料，PCR级水阴性对照没有产生的qPCR产品。
一个成功的qPCR运行的另一个指标是一个很好的的熔解曲线分析，可以洞察到样品中的潜在污染。要建立一个熔化温度，缓慢加热后的PCR完成板。由于DNA链分开，SYBR GREEN被释放，并降低荧光信号。温度在这个博士OP发生作图，作为样品的熔融温度。根据DNA序列，样品融化在彼此和水阴性对照，不应该有一个熔化温度，因为没有DNA存在不同的温度。从每对引物的PCR产物，应该在类似的温度融化。例如，图3显示了两个不同的引物重复使用同一样品的熔解曲线分析。很明显的熔化温度不同，但两个引物对样本是在完全相同的温度融化为每个复制。坏或可能受到污染的样品的迹象，可能包括几个熔融峰，表明存在两个不同的输入源。
出现图1。前的microRNA签名通过使用一种新型的qPCR基于阵列分析。平均deltaCTU6计算ArrayMinerTM软件装入标准值，高产heatmaps显示3个不同的集群。 （一）前的microRNA表达的小变化显示。前小分子RNA，其水平显着下降（B）或增加（三）也显示。蓝对应的表达水平较低，而红色代表表达水平增加。
图2：在qPCR的基于前的microRNA阵列的内部控制的共享。 3种不同的基因和无模板控制的原始CT值显示。 U6是用来作为内部阳性对照，PCR检测水作为我们的阴性对照服务。让- 7A - 1 - 1是通常在许多不同类型的细胞表达的microRNA，可以作为一个积极或消极的控制基于细胞系或组织使用的病毒状态，而KSHV的LANA。
图3。熔融峰前的小分子RNA引物和缺乏样品污染的分析。在LightCycler软件的使用TM调用分析熔解曲线获得。重复运行同一样品的两个不同的引物（底漆和B）所示。每个引物的熔融温度是不同的。然而，该样本只有一个高峰，展示了样品污染缺乏。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
QPCR是一个高度敏感的检测可以用来比较样本之间的基因表达水平，在一项研究中，以及在病毒的情况下，以确定阳性。使用的qPCR阵列的好处是每个样品许多引物（在我们的例子中，186对引物），在很短的时间内运行的能力。使用特餐自由EVO，设置可以进一步减少实验所需的时间，和机器人的准确性和一致性，如移液机器人，可以减少和消除移液错误。在这里，我们将演示如何使用特餐自由埃沃设立的microRNA阵列，以及作为一种替代方法，使用矩阵电子多道移液器，谁没有访问一个移液机器人实验室，可用于实施。的qPCR阵列也是有利的，因为所有的基因，可以归到一个单一的同一个盘子上运行的参考基因，降低成本和反应。
正如前面提到的，有几个主要特点，设计这样的一个数组时所必需的。由于PCR板所有样品将在相同的条件下运行，这是设计引物，在相同的温度和设置，或一些对引物函数将失败的关键。设计引物时，应始终被检查的序列BLAST搜索，以确保有您的利益，没有其他基因的基因同源性。
当运行的阵列，它是关键，环境是无菌的，PCR的污染物，可能会导致误报。如果可能的话，PCR应设立在无菌工作橱或一个独立的洁净室，PCR产物是从来没有使用过。应洗净，用长凳Eliminase，水和乙醇，而遭受至少一个小时的紫外线照射后，运行完成。
这项技术的好处是，同样的策略是适用于任何设置，只需更换一个数组包含一个不同的引物对集的miRNA阵列异形基因。我们的实验室目前包含前的miRNA，KSHV的，EBV，P53，和NFKB阵列 - 所有这一切都可以在相同的方法所显示的运行。这个实验的灵活性，使我们的实验室快速，可靠地执行，我们希望屏幕的任何引物对高通量基因分析。
在这里，我们描述了在激活后，使用人类细胞系的cDNA阵列分析miRNA表达水平超过一段时间。此外表征细胞株中，数组也可以被用来分析临床标本。 RNA分离，cDNA合成，并可以运行使用这个数组来描述基因表达的cDNA。这可以有助于确定病毒阳性，或基因的表达谱，以进一步确定哪些基因是从受感染患者的样本上调。总之，自动定量PCR基于阵列，使高度敏感的，各种各样的及时组织和细胞株的基因检测的重复性和可靠的检测。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院拨款DE018304，R01DE018281支持。 KT公司是由T32 - 34 GM07092授予教堂山北卡罗来纳大学霍华德休斯医学研究所（HHMI）的通过MED到毕业倡议的支持。 PC支持的T32 CA009156。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom Evo 150 | Tecan Group Ltd. | 30017587 | |
| Matrix Electronic Multichannel Pipette | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2001-MTX | (or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above) |
| Matrix Integrity Filter Tips, Sterile | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7435 | (or comparable tip for multichannel used) |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche Group | 04 707 516 001 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Group | 05015243001 | 384-well version |
| Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche Group | 04729749001 | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Group | 04729757001 | |
| LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software | Roche Group | 05075122001 | |
| Eliminase Decontaminant | Decon Laboratories | 04-355-31 |
References
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention. J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).
- O'hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
