נדגים את ההתקנה וניתוח של microRNA טרום 96-היטב עבור מערכים QPCR באמצעות רובוט, כמו גם על ידי ביד עם פיפטה מדעי רב מטריקס Thermo.
Abstract
כמותי בזמן אמת PCR (QPCR) התפתחה ככלי מדויק יקר פרופיל רמות ביטוי הגנים. אחד היתרונות הרבים גבול גילוי נמוכה בהשוואה לשיטות אחרות של פרופילי ביטוי גנים, תוך שימוש בכמויות קטנות של קלט עבור כל assay. התקנה אוטומטית qPCR השתפר בתחום הזה על ידי המאפשר שחזור יותר. ההתקנה נוחה ומהירה שלה מאפשר תפוקה גבוהה ניסויים, המאפשרת אפיון של גנים רבים ושונים בו זמנית בכל ניסוי. שיטה זו, יחד עם צלחת בקרות פנימיות גם מקטין את משתני הניסוי המשותף טכניקות אחרות. אנחנו לאחרונה פיתחה assay qPCR עבור פרופילים של טרום רנ"א (טרום miRNAs) באמצעות סדרה של 186 זוגות פריימר. מיקרו RNA צמחו כמעמד של רומן קטן, ללא קידוד RNAs עם היכולת לווסת את מטרות mRNA רבים ברמה שלאחר תעתיק. RNAs אלה קטן מתועתקים הראשונה מירנה תעתיק הראשי (פרי, מירנה), אשר ביקע מכן לתוך מירנה המבשר (טרום מירנה) על ידי RNA פולימראז II. טרום miRNAs מיוצאים הציטופלסמה שבה דייסר cleaves את הלולאה מכבנה להניב miRNAs בוגרת. עליות ברמות מירנה ניתן לצפות ב מבשר והן רמות מירנה בוגרת פרופיל של שתי צורות אלה יכול להיות שימושי. ישנם מבחני זמינים מסחרית מספר miRNAs בוגרת, אך העלות הגבוהה שלהם עשוי להרתיע חוקרים טכניקה זו פרופיל. כאן, אנו דנים חסכונית, אמינות, SYBR מבוססי שיטה qPCR של אפיון מראש miRNAs. שינויים מירנה מראש רמות לעתים קרובות לשקף שינויים מירנה בוגרת יכולה להיות אינדיקציה שימושית הביטוי מירנה בוגרת. עם זאת, פרופיל סימולטני של שתי טרום miRNAs ו miRNAs בוגרת יכול להיות אופטימלי כפי שהם יכולים לתרום מידע nonredundant ולספק תובנות עיבוד microRNA. יתרה מכך, טכניקה המתואר כאן ניתן להרחיב להקיף את פרופיל של קבוצות אחרות ספריית המסלולים או פתוגנים ספציפיים.
Protocol
טרום מירנה מערכים qPCR פרופיל ניתן להגדיר בתור אוטומטי לחלוטין עם חופש לטקאן Evo רובוט (א) או על ידי ביד עם פיפטה מטריקס אלקטרוניקה רב (B). 1) מכינים את תערובת הורים, צלחות פריימר דגימות. …
Discussion
QPCR הוא assay רגישה מאוד, כי ניתן להשתמש כדי להשוות רמות ביטוי הגנים בין דגימות במחקר, כמו גם כדי לקבוע חיוביות במקרה של וירוסים. היתרון של שימוש במערכים qPCR הוא היכולת להריץ primers רבים (במקרה שלנו, 186 זוגות פריימר) עבור מדגם זה בתקופה קצרה של זמן. באמצעות רובוט pipetting כגון חופש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים DE018304, R01DE018281. KT נתמך על ידי GM07092 T32-34 ו – ידי מענק של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל של הווארד יוז רפואי במכון (HHMI) באמצעות מד גראד לתוך היוזמה. מחשב נתמך על ידי T32 CA009156.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Freedom Evo 150
Tecan
30017587
Matrix Electronic Multichannel Pipette
Thermo Scientific
2001-MTX
(or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above)
Chugh, P., Tamburro, K., Dittmer, D. P. Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays. J. Vis. Exp. (46), e2210, doi:10.3791/2210 (2010).