Summary
हम सेटअप और पूर्व microRNA की विश्लेषण प्रदर्शन करेंगे qPCR के लिए 96 अच्छी तरह से arrays के थर्मो वैज्ञानिक मैट्रिक्स multichannel विंदुक के साथ हाथ से एक रोबोट के रूप में अच्छी तरह के रूप में उपयोग.
Abstract
मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) जीन अभिव्यक्ति के स्तर की रूपरेखा में एक सटीक और मूल्यवान उपकरण के रूप में उभरा है. इसके कई फायदे में से एक कम का पता लगाने जबकि प्रत्येक परख के लिए इनपुट के छोटे मात्रा का उपयोग जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा के अन्य तरीकों की तुलना में सीमा है. स्वचालित qPCR सेटअप अधिक reproducibility के लिए अनुमति देकर इस क्षेत्र में सुधार हुआ है. इसकी सुविधाजनक है और तेजी से सेटअप उच्च throughput प्रयोगों के लिए अनुमति देता है, एक साथ कई अलग अलग जीनों की रूपरेखा प्रत्येक प्रयोग में सक्षम करने. आंतरिक प्लेट नियंत्रण के साथ साथ यह विधि भी प्रायोगिक अन्य तकनीकों के लिए आम चर कम कर देता है. हमने हाल ही में पूर्व microRNAs की रूपरेखा के लिए एक qPCR परख (miRNAs पूर्व) 186 प्राइमर जोड़े का एक सेट का उपयोग कर विकसित किया है. MicroRNAs बाद transcriptional स्तर पर कई mRNA लक्ष्य को विनियमित करने की क्षमता के साथ छोटे, गैर कोडन RNAs के एक उपन्यास वर्ग के रूप में उभरा है. इन छोटे RNAs पहली बार एक प्राथमिक (प्राथमिक miRNA) miRNA प्रतिलेख, जो तब अग्रदूत miRNA (पूर्व miRNA) में cleaved है के रूप में शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय द्वारा लिखित. पूर्व miRNAs cytoplasm जहां पासा खेलनेवाला बाल के लिये कांटा पाश cleaves परिपक्व miRNAs उपज के लिए निर्यात कर रहे हैं. MiRNA के स्तर में वृद्धि दोनों अग्रदूत और परिपक्व miRNA स्तर इन दोनों रूपों के की रूपरेखा पर देखा जा सकता है उपयोगी हो सकता है. परिपक्व miRNAs के लिए कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध assays हैं, तथापि, अपने उच्च लागत इस रूपरेखा तकनीक से शोधकर्ताओं को रोकते हो सकता है. यहाँ, हम एक लागत प्रभावी, विश्वसनीय, पूर्व miRNAs रूपरेखा के SYBR आधारित qPCR विधि पर चर्चा की. पूर्व miRNA के स्तर में परिवर्तन अक्सर परिपक्व miRNA परिवर्तनों को प्रतिबिंबित करने और परिपक्व miRNA अभिव्यक्ति का एक उपयोगी सूचक हो सकता है. हालांकि, दोनों पूर्व miRNAs और परिपक्व miRNAs के साथ - साथ रूपरेखा इष्टतम के रूप में वे nonredundant जानकारी के योगदान और microRNA प्रसंस्करण में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं हो सकता है. इसके अलावा, इस तकनीक यहाँ वर्णित विशिष्ट रास्ते या रोगजनकों के लिए अन्य लायब्रेरी सेट की रूपरेखा धरना विस्तारित किया जा सकता है.
Protocol
qPCR पूर्व miRNA रूपरेखा सरणियों के रूप में स्थापित किया जा सकता Tecan स्वतंत्रता Evo रोबोट (ए) के साथ या मैट्रिक्स इलेक्ट्रॉनिक multichannel विंदुक (बी) के साथ हाथ से पूरी तरह से स्वचालित है.
1) मास्टर मिश्रण, प्राइमर प्लेटें और नमूने तैयार करें.
- प्राइमर 12:05 पर 96 अच्छी तरह प्रारूप (कुल 2 प्लेटों के) में 186 प्राइमर जोड़े युक्त प्लेटें -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए कमरे के तापमान, भंवर और उपयोग करने से पहले अपकेंद्रित्र संक्षिप्त में पिघलना बाहर प्लेटें.
- मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए, कमरे के तापमान पर SYBR ग्रीन 2x पीसीआर मिक्स पिघलना. प्रत्येक प्रतिक्रिया 2ul प्राइमर के साथ 8ul मास्टर मिश्रण का उपयोग करता है. प्रतिक्रिया प्रति मास्टर मिश्रण की संरचना 4ul SYBR मिश्रण, 3ul पीसीआर ग्रेड पानी और 10-20 एनजी नमूना डीएनए या सीडीएनए है.
- 96 अच्छी तरह से प्रत्येक प्राइमर प्लेट की स्थापना के लिए, चार मास्टर मिश्रण ट्यूबों की जरूरत होगी. नमूने 4 प्लेट प्रति नमूने (singlicate), प्लेट प्रति 2 नमूने (डुप्लिकेट) या चार प्रतियों में एक ही नमूना चलाया जा सकता है.
- 4-2ml Eppendorf ट्यूबों के प्रत्येक में SYBR, पानी, और नमूने के संयोजन के द्वारा मास्टर मिश्रण तैयार करें. प्रत्येक ट्यूब लगभग 100 प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त मास्टर मिश्रण होते हैं, बर्बाद pipetting के लिए अतिरिक्त अनुमति चाहिए. मिश्रण भंवर.
पूर्व miRNA स्वतंत्रता Tecan Evo रोबोट का उपयोग परख के ए सेटअप.
- रोबोट और Evoware कार्यक्रम की लोडिंग के आरंभीकरण के बाद, 30mls प्रत्येक के साथ तीन बार फ्लश करने के लिए हवाई बुलबुले कि सटीकता pipetting के साथ हस्तक्षेप करेगा सिस्टम साफ.
- रोबोट मंच सेटअप करने के लिए निम्नलिखित शामिल हैं:
- 384 अच्छी तरह से लेबल प्लेट
- 96 अच्छी तरह से प्राइमर प्लेट (1)
- मास्टर घोला जा सकता है
- एक 2% ब्लीच युक्त गर्त
- एक भरा प्रणाली द्रव कंटेनर
- रिक्त बर्बाद कंटेनर
- "भागो" दो बार चयन करके स्वचालित रोबोट चलाने शुरू करो.
- कार्यक्रम के अंत में, LightCycler 480 सील पन्नी के साथ 384 अच्छी तरह से थाली और सील हटाने और संक्षिप्त अपकेंद्रित्र. प्लेस होटल 1 की स्थिति में 384 अच्छी तरह से थाली मुहरबंद.
- 2.2 कदम और नए मास्टर घोला जा सकता है और एक नया 384 - अच्छी तरह से थाली के साथ प्राइमर 2 प्लेट के लिए दोहराने के लिए जाओ.
- 2 होटल की स्थिति में सील थाली प्लेस.
- होटल से Lightcycler लोड हो रहा है और चयन में दो बार "भागो" के लिए ओपन नए Evoware कार्यक्रम.
- स्वतंत्रता Evo स्वचालित रूप से प्रत्येक थाली में LightCycler लोड होगा और निम्नलिखित SYBR हरे मैं / मानव संसाधन विकास मंत्री सायक्लिंग कार्यक्रम चलाने:
पूर्व (1 चक्र):
4.8 के रैंप दर पर 5 मिनट के लिए 50 ° ° / सेक
4.8 के रैंप दर पर 5 मिनट के लिए 95 ° ° / सेक
Amp (45 चक्र):
4.8 के रैंप दर पर 15 सेकंड के लिए 95 ° ° / सेक
2.5 के रैंप दर पर 30 सेकंड के लिए 62 ° ° / सेक
(एकल डाटा अधिग्रहण के इस कदम के दौरान)
पिघलती वक्र:
5 सेकंड के लिए 4.8 के रैंप दर पर 95 ° ° / सेक
2.5 के रैंप दर पर 1 मिनट के लिए 60 ° ° / सेक
95 ° .11 रैंप दर ° / सेक निरंतर
5 डिग्री सेल्सियस प्रति अधिग्रहण के साथ
कूल:
25 के रैंप दर पर 30 सेकंड के लिए 50 ° ° / सेक
- स्वतंत्रता Evo स्वचालित रूप से प्रत्येक थाली में LightCycler लोड होगा और निम्नलिखित SYBR हरे मैं / मानव संसाधन विकास मंत्री सायक्लिंग कार्यक्रम चलाने:
पूर्व miRNA मैट्रिक्स इलेक्ट्रॉनिक multichannel विंदुक का उपयोग परख बी सेटअप:
- एक जलाशय में मास्टर मिश्रण एक ट्यूब के प्लेस सामग्री.
- इलेक्ट्रॉनिक 2 - 8ul के साथ मास्टर मिश्रण के 16ul aspirate बाद एक शुद्ध कदम से कदम बांटना विंदुक सेट.
- मास्टर मिश्रण के लिए 1, 384 अच्छी तरह से थाली (384 अच्छी तरह से टिप रिक्ति पर सेट) के हर दूसरे कुएँ में 8ul बांटना, के साथ अच्छी तरह से A1 शुरुआत है. (यानी कुओं A1, C1, E1, आदि) के लिए दूसरा 8ul बांटना, 3 स्तंभ (यानी कुओं A3, C3, E3, आदि) तो बर्बादी कंटेनर और निपटान के सुझावों पर शुद्ध करने के लिए कदम.
- शेष 5 चक्रों के लिए इस पैटर्न का पालन करें जब तक आप अच्छी तरह से A23 तक पहुँचने.
- मास्टर मिश्रण के लिए 2 दोहराएँ, (अच्छी तरह से A2, C2, E2, आदि के साथ शुरुआत), मास्टर मिश्रण 3 (अच्छी तरह से बी 1, D1, F1, आदि पर शुरुआत), मास्टर 4 मिश्रण (शुरुआत में बी 2, D2, F2, आदि ).
- प्राइमर थाली के aliquotting के लिए, इलेक्ट्रॉनिक 2ul aspirate और एक शुद्ध कदम निम्नलिखित के साथ 2ul बांटना विंदुक सेट. 384 अच्छी तरह से थाली, कुओं A1, C1, E1, आदि बर्बादी कंटेनर और निपटान के सुझावों पर पर्ज में 96 अच्छी तरह से प्राइमर प्लेट (आह) के एक स्तंभ से प्राइमरों के 2ul बांटना. बी 1, D1, F1, और बी 2, D2, F2, आदि कुओं A2, C2, E2 के लिए दोहराएँ
- 2-12 96 अच्छी तरह से प्राइमरों की पंक्तियों के लिए दोहराएँ, प्रत्येक प्राइमर स्तंभ के लिए हर 2 कॉलम पर चलती है, जब तक पूरा 384 अच्छी तरह से थाली aliquotted किया गया है.
- LightCycler सील पन्नी और संक्षिप्त अपकेंद्रित्र के साथ सील प्लेटें.
- 480 LightCycler और निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग SYBR ग्रीन मैं / मानव संसाधन विकास मंत्री का पता लगाने के स्वरूप के अनुसार प्लेटों चक्र में प्लेटें प्लेस:
पूर्व (1 चक्र):
4.8 के रैंप दर पर 5 मिनट के लिए 50 ° ° / सेक
4.8 के रैंप दर पर 5 मिनट के लिए 95 ° ° / सेक
Amp (45 चक्र):
रैंप दर पर 95 सेकंड के लिए 15 °4.8 ° / सेक
2.5 के रैंप दर पर 30 सेकंड के लिए 62 ° ° / सेक
(एकल डाटा अधिग्रहण के इस कदम के दौरान)
पिघलती वक्र:
5 सेकंड के लिए 4.8 के रैंप दर पर 95 ° ° / सेक
2.5 के रैंप दर पर 1 मिनट के लिए 60 ° ° / सेक
95 ° .11 रैंप दर ° / सेक निरंतर
5 डिग्री सेल्सियस प्रति अधिग्रहण के साथ
कूल:
25 के रैंप दर पर 30 सेकंड के लिए 50 ° ° / सेक - प्राइमर का उपयोग कर प्लेट 2 दोहराएँ, 384 अच्छी तरह से एक ताजा हौसले से तैयार मास्टर घोला जा सकता है का उपयोग कर प्लेट में aliquotting.
सफलता के लिए रहस्य:
जब पीसीआर सरणियों डिजाइन एक महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि सभी 186 प्राइमर जोड़े एक ही annealing तापमान है, तो थाली एक ही इष्टतम पीसीआर रन प्रोग्राम सेटिंग्स पर चला जा सकता है है.
प्रत्येक नई सरणी तीन नियंत्रण का उपयोग कर के चल नमूने से पहले जाँच की जानी चाहिए. इन नियंत्रण कर रहे हैं हैं:
पानी या 0.1 x ते के साथ चलाने के बाहर प्राइमर संदूषण नियम प्राइमरों की 1 रन.
1 / पानी ते और सकारात्मक नियंत्रण बारी चलाने के लिए, कोई carryover सुनिश्चित.
3 ही सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग कर चलाता है, रन के बीच reproducibility सुनिश्चित है.
मास्टर घोला जा सकता है हौसले हो, तैयार किया जाना चाहिए और प्लेटें इष्टतम परिणामों के लिए 24 घंटे के भीतर चला होना चाहिए
प्राइमर थाली पन्नी धीरे धीरे हटा दिया जाना चाहिए कुओं के बीच संक्रमण के जोखिम को कम.
जब तय सुझावों के साथ एक रोबोट का उपयोग करते हुए, 2% धोने ब्लीच करने के लिए सुझावों के प्रत्येक pipetting कदम के बीच एक पानी की फ्लश द्वारा पीछा किया धोने के लिए आवश्यक है. यह रोकता है और समाप्त carryover, जो अन्यथा डेटा दूषित अनिर्णायक परिणाम के लिए नेतृत्व सकता है.
के बाद एक थाली Lightcycler के माध्यम से चलाया जाता है, इसे फिर से पीसीआर सेटअप कमरे में नहीं खोला जाना चाहिए. यह पीसीआर संदूषण को रोकने में मदद करता है.
प्रतिनिधि परिणाम:
qPCR परिणाम आम तौर पर सीटी के रूप में Lightcycler विश्लेषण सॉफ्टवेयर से निर्धारित मूल्यों द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. आम तौर पर एक सफल चलाने के नमूने है कि सकारात्मक रहे हैं के लिए नमूने के लिए 20-35 के बीच आमतौर पर cts के एक सीमा के होते हैं. एक अच्छा समय में पानी के नमूने> 40 के एक सीटी में हमेशा से रहे हैं और किसी भी या 37 से अधिक नमूने एक सीटी के साथ विशिष्ट कुओं नकारात्मक या नहीं पाया माना जाता है. एक सामान्य नियम के रूप में, <10 की सीटी उपज के नमूने भी अविश्वसनीय हैं और आगे के विश्लेषण से बाहर रखा. वहाँ हमारी परख में qPCR डेटा विश्लेषण और आंतरिक नियंत्रण के शामिल किए जाने के कई तरीके हैं नमूना इनपुट के बदलाव के लिए नियंत्रण में मदद करता है है. पूर्व - मीर सरणी U6 नियंत्रण प्राइमर, जो अक्सर एक संदर्भ के विभिन्न नमूनों से सीटी मूल्यों सामान्य जीन के रूप में प्रयोग किया जाता है शामिल हैं. इस सामान्यीकृत मान डेल्टा सीटी मूल्य (डीसीटी) के रूप में संदर्भित किया जाता है. परिणाम अक्सर कच्चे सीटी, डीसीटी मूल्य के रूप में रेखांकन कर रहे हैं या आगे मानकीकृत मूल्यों के विश्लेषण कर सकते हैं.
चित्रा 1 में एक timecourse प्रयोग से चार अलग अलग नमूनों की पूरी सरणी पूर्व microRNA विश्लेषण गर्मी नक्शा स्वरूप में प्रस्तुत किया है. प्रत्येक पूर्व microRNA के रिश्तेदार अभिव्यक्ति दिखाया है और तीन प्रमुख, विशिष्ट समूहों में उभरा. विश्लेषण पूर्व miRs के बहुमत छोटे, तुच्छ परिवर्तन कराना पड़ा के रूप में की उम्मीद (चित्र 1A). हालांकि, पूर्व microRNAs के एक छोटे से हिस्से में काफी (चित्रा 1 बी) की कमी हुई थे या नाटकीय रूप से timecourse प्रयोग भर में (चित्रा 1C) की वृद्धि हुई. प्रत्येक पूर्व microRNA की अभिव्यक्ति के स्तर के एक आधारभूत स्तर के रूप में 0h timepoint (1 नमूना) के लिए सामान्यीकृत किया गया. कुछ उदाहरणों में, आप ध्यान दें सकता है कि संकुल पूर्व microRNAs के कुछ भी हीटमैप विश्लेषण में एक साथ क्लस्टर (पूर्व: चलो 7a, चित्रा 1 बी). प्रयोग के आधार पर समूहों में उभर सकता है कि वायरल संक्रमण पर निर्भर हैं, पूर्व microRNAs या पूर्व miRs सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति है कि एक आम अणु या संकेतन मार्ग द्वारा विनियमित रहे हैं.
पूर्व microRNA परख है कि हम भी विकसित किया है में जाना जाता वायरल पूर्व microRNAs और जीन है Kaposi मानव - पूर्व miRs के अलावा herpesvirus (KSHV) और Epstein बर्र वायरस (EBV) एसोसिएटेड सारकोमा द्वारा इनकोडिंग की एक संख्या शामिल हैं. ये सकारात्मक या नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, सेल लाइन और वायरल इस्तेमाल किया नमूनों की स्थिति पर निर्भर करता है. चित्रा 2 में, एक KSHV नकारात्मक चार प्रतियों में चलाने के नमूने से औसत CTS दिखाए जाते हैं. महत्वपूर्ण बात, इस नमूने में KSHV लाना बेहद संवेदनशील qPCR सरणी के द्वारा पता नहीं था. हालांकि, U6 - हमारी आंतरिक नियंत्रण और दो 7a - एक अत्यधिक व्यक्त मानव पूर्व microRNA, detectable स्तर पर व्यक्त किया गया. अंत में, के रूप में की उम्मीद, पीसीआर ग्रेड पानी की नकारात्मक नियंत्रण qPCR उत्पाद उपज नहीं था.
एक सफल qPCR चलाने का एक अन्य संकेतक एक अच्छा पिघलने वक्र विश्लेषण, जो नमूनों में संभावित संदूषण में अंतर्दृष्टि दे सकते हैं. पिघलने के तापमान की स्थापना के लिए, थाली धीरे धीरे गरम किया जाता है के बाद पीसीआर पूरा हो गया है. डीएनए के रूप में अलग किस्में, SYBR हरी जारी है, और प्रतिदीप्ति संकेत कम हो जाती है. तापमान पर जो इस डॉ.सेशन रेखांकन होता है, और नमूना तापमान के पिघलने के रूप में जाना जाता है. डीएनए अनुक्रम पर निर्भर करता है, नमूने एक दूसरे से और पानी नकारात्मक नियंत्रण है, जो एक पिघलने तापमान नहीं है के बाद से कोई डीएनए मौजूद है चाहिए से अलग तापमान पर पिघला. प्रत्येक प्राइमर जोड़ी से पीसीआर उत्पादों समान तापमान पर पिघल चाहिए. उदाहरण के लिए, चित्रा 3 में दो अलग अलग दो प्रतियों में ही नमूना का उपयोग प्राइमरों के लिए एक पिघलने वक्र विश्लेषण से पता चलता है. यह स्पष्ट है कि तापमान के पिघलने दो प्राइमर जोड़े के लिए अलग है, लेकिन नमूना प्रत्येक को दोहराने के लिए सटीक एक ही तापमान पर पिघल रही है. एक बुरा या संभावित दूषित नमूने के लक्षण कई पिघलने चोटियों शामिल इनपुट के दो विभिन्न स्रोतों की उपस्थिति का सुझाव दे सकता है.
चित्रा 1 पूर्व microRNA हस्ताक्षर एक उपन्यास qPCR आधारित सरणी का उपयोग रूपरेखा के माध्यम से उभरेगा. औसत deltaCTU6 गणना था और मानकीकृत मूल्यों ArrayMinerTM सॉफ्टवेयर में लोड किया गया, 3 अलग heatmaps के रूप में प्रदर्शित समूहों उपज है. (ए) पूर्व अभिव्यक्ति में छोटे परिवर्तन के साथ microRNAs दिखाए जाते हैं. पूर्व microRNAs जिसका स्तर में काफी कमी आई (बी) या वृद्धि हुई है (सी) भी दिखाए जाते हैं. ब्लू अभिव्यक्ति की निचले स्तर से मेल खाती है है जबकि लाल अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 2 qPCR आधारित पूर्व microRNA सरणी में आंतरिक नियंत्रण के शामिल. 3 अलग जीन और एक नहीं टेम्पलेट नियंत्रण के लिए कच्चे सीटी मूल्यों दिखाए जाते हैं. U6 एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है जबकि पीसीआर H2O हमारे नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. चलो - 7a-1-1 एक आम तौर पर कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं में व्यक्त microRNA जबकि KSHV लाना या तो एक सकारात्मक या नकारात्मक नियंत्रण, कोशिका लाइन या ऊतक का इस्तेमाल वायरल स्थिति पर आधारित के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
चित्रा 3 पूर्व microRNA प्राइमरों और संदूषण नमूना की कमी के शिखर विश्लेषण पिघलती है . पिघलती घटता LightCycler सॉफ्टवेयर में Tm बुला विश्लेषण का उपयोग प्राप्त किया गया. दो प्रतियों में ही चलाने के नमूने के लिए दो अलग प्राइमरों (एक प्राइमर और बी) दिखाए जाते हैं. प्रत्येक प्राइमर के लिए पिघलने के तापमान अलग है. हालांकि, नमूना केवल एक चोटी है, नमूना संदूषण की कमी का प्रदर्शन.
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Discussion
QPCR एक बेहद संवेदनशील परख है कि नमूनों के बीच एक अध्ययन में जीन की अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वायरस के मामले में धनात्मकता निर्धारित है. qPCR arrays का उपयोग करने के लाभ के लिए प्रत्येक नमूना के लिए समय की एक छोटी अवधि में कई प्राइमरों (हमारे मामले में, 186 प्राइमर जोड़े) चलाने की क्षमता है. Tecan स्वतंत्रता Evo, आगे कम किया जा सकता है एक प्रयोग सेट करने के लिए आवश्यक समय की राशि, और रोबोट की सटीकता और स्थिरता के रूप में एक pipetting रोबोट का प्रयोग कम और pipetting त्रुटियों को समाप्त कर सकते हैं. यहाँ हम कैसे एक Tecan स्वतंत्रता एवो का उपयोग करने के लिए एक microRNA सरणी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक वैकल्पिक विधि का उपयोग कर एक मैट्रिक्स इलेक्ट्रॉनिक Multichannel पिपेट, जो प्रयोगशालाओं जो एक pipetting रोबोट के लिए पहुँच नहीं है के लिए लागू किया जा सकता सेट प्रदर्शित. qPCR सरणियों भी फायदेमंद है क्योंकि सभी जीनों संदर्भ एक ही थाली पर चलाने के जीनों का एक सेट सामान्यीकृत किया जा सकता है, और प्रतिक्रियाओं की लागत संख्या को कम करने.
के रूप में उल्लेख किया है, वहाँ कई प्रमुख विशेषताएं है कि आवश्यक हैं जब इस तरह के एक सरणी डिजाइन कर रहे हैं. पीसीआर प्लेट पर सभी नमूनों के बाद से समान शर्तों पर चलाया जाएगा, यह है कि एक ही तापमान और सेटिंग्स, या कुछ प्राइमर जोड़े पर समारोह असफल हो जायेगी डिजाइन प्राइमरों के लिए महत्वपूर्ण है. जब प्राइमरों डिजाइन, दृश्यों हमेशा ब्लास्ट खोज द्वारा जाँच की जानी चाहिए करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहाँ अपने जीन को ब्याज और कोई अन्य जीन की समरूपता है.
जब सरणी चल रहे हैं, यह महत्वपूर्ण है कि पर्यावरण बाँझ और पीसीआर contaminants के कि झूठी सकारात्मक परिणाम में हो सकता है से मुक्त है. यदि संभव हो तो, पीसीआर एक बाँझ काम डाकू या एक अलग साफ कमरे, जहां पीसीआर उत्पादों का इस्तेमाल कभी नहीं किया है स्थापित करना चाहिए. न्यायपीठों Eliminase, पानी और इथेनॉल के साथ धोया होना चाहिए, और कम से कम एक घंटे के लिए यूवी प्रकाश के अधीन बाद रन पूरा हो गया है.
इस तकनीक का लाभ यह है कि यह एक ही रणनीति के लिए बस एक सरणी के साथ एक अलग प्राइमर जोड़ी सेट युक्त miRNA सरणी की जगह द्वारा profiled जीनों के किसी भी सेट के लिए लागू होता है. जो सभी के दिखाया उन के लिए एक समान विधि में चलाए जा सकता है है - हमारी प्रयोगशाला वर्तमान में पूर्व miRNAs, KSHV, EBV, p53, और NFkB के लिए arrays शामिल हैं. इस परख के लचीलेपन हमारी प्रयोगशाला उच्च throughput जीन रूपरेखा प्रदर्शन करने के लिए किसी भी प्राइमर जोड़े है कि हम करने के लिए स्क्रीन चाहते हैं के लिए तेजी से और मज़बूती से अनुमति देता है.
यहाँ, हम प्रोफ़ाइल miRNA अभिव्यक्ति के स्तर के लिए समय की अवधि से अधिक सक्रियण पर मानव कोशिका लाइनों से सीडीएनए का उपयोग सरणी का वर्णन किया. सेल लाइनों निस्र्पक के अलावा, सरणी भी नैदानिक नमूनों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. शाही सेना के अलगाव के बाद, सीडीएनए संश्लेषण प्रदर्शन किया जा सकता है है और इस सरणी का उपयोग करने के लिए जीन की अभिव्यक्ति विशेषताएँ सीडीएनए चलाया जा सकता है. यह वायरल धनात्मकता, या जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल को निर्धारित करने के लिए आगे विशेषताएँ जीन जो संक्रमित रोगियों के नमूनों में upregulated हैं में उपयोगी हो सकता है. संक्षेप में, स्वचालित qPCR आधारित arrays प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय assays कि एक समय पर फैशन में और ऊतकों और सेल लाइनों से जीनों की एक विस्तृत विविधता के बेहद संवेदनशील पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम एनआईएच DE018304 अनुदान, R01DE018281 द्वारा समर्थित किया गया. के.टी. T32 GM07092-34 और हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल मेड के माध्यम से (HHMI) ग्रैड पहल में संस्थान से चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित है. पीसी T32 CA009156 द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom Evo 150 | Tecan Group Ltd. | 30017587 | |
| Matrix Electronic Multichannel Pipette | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2001-MTX | (or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above) |
| Matrix Integrity Filter Tips, Sterile | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7435 | (or comparable tip for multichannel used) |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche Group | 04 707 516 001 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Group | 05015243001 | 384-well version |
| Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche Group | 04729749001 | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Group | 04729757001 | |
| LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software | Roche Group | 05075122001 | |
| Eliminase Decontaminant | Decon Laboratories | 04-355-31 |
References
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention. J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).
- O'hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
