Summary
Мы продемонстрируем, настройки и анализа предварительного микроРНК 96-луночного массивы для КПЦР использованием роботов, а также вручную с помощью пипетки Thermo Scientific многоканальный Matrix.
Abstract
Количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР) стал точным и ценным инструментом в профилирования уровни экспрессии генов. Один из его многочисленных достоинств является нижний предел обнаружения по сравнению с другими методами генной профилирования выражения при использовании меньшего количества входа для каждого теста. Автоматизированные установки КПЦР улучшилась этой области, позволяя большей воспроизводимости. Его удобно и быстро и эффективно настроить обеспечивает высокую пропускную способность эксперименты, позволяя профилирования из многих различных генов одновременно в каждом эксперименте. Этот метод наряду с внутреннего контроля пластины также снижает экспериментальных переменных, общих для других методов. Недавно мы разработали КПЦР тест для профилирования предварительно микроРНК (предварительно микроРНК), используя набор из 186 пар праймеров. Микро РНК появились как новый класс малых, некодирующих РНК с возможностью регулировать многие цели мРНК на пост-уровне транскрипции. Эти небольшие РНК транскрибируется первой РНК-полимеразой II в качестве основного микроРНК (PRI-микроРНК) транскрипт, который затем расщепляется на предшественников микроРНК (предварительно микроРНК). Предварительно микроРНК экспортируется в цитоплазму, где Dicer расщепляет петли шпильки для получения зрелых микроРНК. Повышение уровней микроРНК можно наблюдать как на предшественников и зрелых уровни микроРНК и профилирование обе эти формы могут быть полезны. Есть несколько коммерчески доступных тестов для зрелых микроРНК, однако их высокая стоимость может отпугнуть исследователей из этого профилирования технику. Здесь мы рассмотрим экономически эффективных, надежных, SYBR основе КПЦР метод профилирования предварительно микроРНК. Изменения в предварительно микроРНК уровней часто отражают изменения зрелых миРНК и может быть полезным индикатором зрелого выражения микроРНК. Тем не менее, одновременное профилирование как до, так и зрелые микроРНК микроРНК может быть оптимальным, так как они могут способствовать неизбыточной информации и обеспечить понимание микроРНК обработки. Кроме того, техника, описанная здесь, может быть расширена, чтобы охватить профилирования других наборов библиотеки для конкретных путей или патогенов.
Protocol
КПЦР предварительно микроРНК массивы профилирование может быть установлен как полностью автоматизированный с Tecan Свобода Эво робота () или вручную с помощью матрицы электронные пипетки многоканальный (B).
1) подготовить мастер смеси, грунтовки пластин и образцов.
- Грунтовка чашки, содержащие 186 пар праймеров в 96-луночного формата (всего 2 пластины) в 12:05 вечера, должны храниться при температуре -80 ° C. Оттепель пластин при комнатной температуре, вихревые и центрифуги кратко перед использованием.
- Для подготовки мастер микс, оттаять SYBR Green 2x ПЦР Mix при комнатной температуре. Каждая реакция использует 8ul Mix Master с 2UL грунт. Состав смеси на мастер реакция 4ul смесь SYBR, 3ul ПЦР класса воды и 10-20 нг образец ДНК или кДНК.
- Для установки каждого 96-луночного грунтовки пластины, четыре трубы мастер смесь будет необходимо. Образцы могут быть запущены 4 пробы на пластину (singlicate), 2 пробы на пластину (дубликат) или одного образца в четырех экземплярах.
- Приготовить базовую смесь, комбинируя SYBR, воды и образцы в каждой из 4-2мл труб Эппендорф. Каждая трубка должна содержать достаточное Mix Master около 100 реакций, что позволяет избыточной для пипетирования отходов. Vortex перемешать.
А. Установка предварительно микроРНК методом с использованием Свобода Tecan Эво робота.
- После инициализации робот и загрузка программы Evoware, промойте в три раза с 30 мл каждая, чтобы очистить систему воздушных пузырей, которые будут мешать пипетирования точности.
- Установка робота платформы включают следующее:
- Маркированный 384-луночного планшета
- 96-луночного планшета грунтовки (1)
- Мастер смешивает
- Корыто, содержащий 2% отбеливатель
- Емкостей, наполненных жидкостью системы
- Пустой контейнер для отходов
- Начало автоматизированного запуска робота, выбрав "Run" в два раза.
- В конце программы, удалять 384-луночного планшета и печать с LightCycler 480 уплотнения фольгой и центрифуги кратко. Место запечатанном 384-луночный планшет в положении 1 от отеля.
- Перейдите к пункту 2.2 и повторить для грунтовки пластины 2 с новых миксов мастера и новые 384-луночного планшета.
- Место запечатанном пластиной в положении 2 отеля.
- Открытие новой программы Evoware для загрузки LightCycler от отеля и выберите пункт "Выполнить" в два раза.
- Свобода Evo будет автоматически загружать каждую тарелку в LightCycler и выполните следующие SYBR-зеленый I / HRM велосипедные программы:
Предварительно (1 цикл):
50 ° в течение 5 минут при рампы темпом 4,8 ° / сек
95 ° в течение 5 минут на рампе скорость 4,8 ° / сек
Amp (45 циклов):
95 ° в течение 15 сек на рампе скорость 4,8 ° / сек
62 ° в течение 30 сек при рампы скоростью 2,5 ° / сек
(Single сбора данных на этом этапе)
Кривая плавления:
95 ° в течение 5 сек на рампе скорость 4,8 ° / сек
60 ° в течение 1 минуты на рампе скоростью 2,5 ° / сек
95 ° непрерывна в рампе скорости 0,11 ° / сек
с 5 приобретений на ° С
Cool:
50 ° в течение 30 сек при рампы скоростью 25 ° / сек
- Свобода Evo будет автоматически загружать каждую тарелку в LightCycler и выполните следующие SYBR-зеленый I / HRM велосипедные программы:
Б. установки предварительного микроРНК методом с использованием электронных Матрица пипетки многоканальный:
- Место содержания мастер смесь трубку 1 в резервуар.
- Установить электронные пипетки для аспирации 16ul мастера смешать с 2-8ul обойтись шаги следует очищать шаг.
- Для мастера смешать 1, отпускать 8ul в любой другой скважины 384-луночного планшета (набор на 384-сетки скважин наконечник), начиная с хорошо A1. (То есть скважины A1, C1, E1 и т.п.) Для второго 8ul обойтись, переходим к колонке 3 (т.е. скважин А3, С3, Е3 и т. д.), то за чистку контейнера отходов и утилизировать советы.
- Следуйте этой модели для оставшихся 5 циклов, пока не достигнете хорошо A23.
- Повторите эти действия для мастера смешать 2, (начиная с хорошо А2, С2, E2 и т.д.), мастер-смесь 3 (начиная с хорошо B1, D1, F1 и т.д.); мастер смеси 4 (начиная с В2, D2, F2 и т.д. .).
- Для aliquotting грунтовки пластина, набор электронных пипетки для аспирации 2UL и обходиться с 2UL следующий шаг чистку. Внесите 2UL праймеров из столбца 1 из 96-луночного планшета грунтовка (АГ) в 384-луночного планшета, колодцы A1, C1, E1 и др. Чистки за контейнер для отходов и утилизировать советы. Повторите эти действия для скважин А2, С2, E2, B1, D1, F1, и В2, D2, F2 и т.д.
- Повторите эти действия для строк 2-12 из 96-и грунтовок, движущихся над каждым 2 колонки для каждого праймера колонку, до полного 384-луночного планшета был aliquotted.
- Уплотнение пластин фольги LightCycler герметизации и центрифуги кратко.
- Место пластин в LightCycler 480 и цикл пластин в соответствии со следующими параметрами с помощью SYBR Green I / HRM определение формата:
Предварительно (1 цикл):
50 ° в течение 5 минут при рампы темпом 4,8 ° / сек
95 ° в течение 5 минут на рампе скорость 4,8 ° / сек
Amp (45 циклов):
95 ° в течение 15 сек на скорость измененияот 4,8 ° / сек
62 ° в течение 30 сек при рампы скоростью 2,5 ° / сек
(Single сбора данных на этом этапе)
Кривая плавления:
95 ° в течение 5 сек на рампе скорость 4,8 ° / сек
60 ° в течение 1 минуты на рампе скоростью 2,5 ° / сек
95 ° непрерывна в рампе скорости 0,11 ° / сек
с 5 приобретений на ° С
Cool:
50 ° в течение 30 сек при рампы скоростью 25 ° / сек - Повторите использованием грунтовки пластины 2, aliquotting в свежем 384-луночного планшета использовании свежеприготовленной смеси мастер.
Секреты успеха:
Важной характеристикой при проектировании ПЦР массивов является то, что все 186 пар праймеров имеют одинаковую температуру отжига, так что пластины могут быть запущены в то же оптимальные параметры запуска программы ПЦР.
Каждый новый массив должен быть проверены с помощью трех элементов управления до запуска образцов. Эти элементы управления являются:
1 прогон всех грунтовки работать с водой или 0,1 х ТЕ, чтобы исключить загрязнение грунтовки.
1 запустить переменного воды / TE и положительного контроля, чтобы убедиться в отсутствии переноса.
3 работает, используя тот же положительный контроль, чтобы обеспечить воспроизводимость между запусками.
Мастер смесей должна быть свежеприготовленной, а тарелки должны быть запущены в течение 24 часов для достижения оптимальных результатов
Фольга Primer пластина должна быть удалена медленно, чтобы уменьшить риск загрязнения между лунками.
При использовании робота с фиксированной советов, 2% отбеливатель мыть нужно мыть советы между каждым шагом пипетки, после чего вода флеш. Это предотвращает и устраняет переноса, которые могли бы загрязнять данных и привести к неубедительные результаты.
После пластины проходят через LightCycler, он не должен быть открыт снова в комнате установки ПЦР. Это помогает предотвратить загрязнение ПЦР.
Представитель Результаты:
КПЦР результаты, как правило, представлены значениями КТ, как определяется из программного обеспечения для анализа LightCycler. Успешного запуска обычно состоит из ряда трансформаторов тока для образцов, как правило, от 20-35 для образцов, которые являются положительными. Пробы воды в хороший пробег всегда в КТ> 40 и какие-либо образцы или конкретных скважинах с КТ более 37 считаются отрицательными или не обнаружено. Как правило, образцы уступая КТ <10 также являются ненадежными и исключаются из дальнейшего анализа. Есть несколько способов, чтобы проанализировать КПЦР данных и включение внутреннего контроля в нашем анализе помогает контролировать отклонений, образец ввода. Предварительно микроРНК массив включает грунтовки U6 управления, который часто используется в качестве ссылки гена для нормализации КТ значения из разных образцов. Это нормализованное значение называется дельта КТ значение (DCT). Результаты часто графически как сырье КТ, стоимость DCT или может быть дополнительно проанализированы на стандартизированные значения.
На рисунке 1, анализ полной предварительно микроРНК массив из четырех различных образцов от timecourse эксперимента приведена на тепло формат карты. Относительном выражении каждого предварительно микроРНК проявляется и три основных, различных кластерах появилось. Большинство предварительно проанализированы миров претерпел небольшие, незначительные изменения, как и ожидалось (рис. 1А). Тем не менее, небольшая часть предварительно микроРНК были значительно снизилась (рис. 1В) или резко возросла (рис. 1C) в течение timecourse эксперимента. Уровни экспрессии каждого предварительно микроРНК были нормированы на 0h timepoint (образец 1) в качестве базового уровня. В некоторых случаях, вы можете заметить, что некоторые из кластерных предварительно микроРНК также кластер вместе в Тепловая карта анализа (например: давайте-7а, рисунок 1В). В зависимости от эксперимента, кластеры могут возникнуть, которые зависят от вирусной инфекции, типа клеток конкретное выражение предварительно микроРНК или предварительно миры, которые регулируются общими молекулы или сигнального пути.
Предварительно микроРНК анализа, которые мы разработали также включает в себя ряд известных вирусных предварительно микроРНК и генов, закодированных Саркома Капоши связанных герпеса (KSHV) и вирус Эпштейна Барр (ВЭБ) в дополнение к человеческой предварительно миров. Они могут быть использованы в качестве положительного или отрицательного контроля, в зависимости от клеточной линии и вирусных статус образцы используются. На рисунке 2, средняя ТТ с KSHV-отрицательный пример работы в четырех экземплярах показаны. Важно отметить, что KSHV LANA не был обнаружен в этом образце высокочувствительных КПЦР массива. Тем не менее, U6 - наш внутренний контроль и пусть-7а - высоко выразил человека предварительно микроРНК, были выражены в поддающихся обнаружению концентраций. Наконец, как и ожидалось, отрицательный контроль ПЦР-класса воды не дали КПЦР продукта.
Еще одним показателем успешного запуска КПЦР это хороший анализ кривой плавления, которые могут дать представление потенциального загрязнения в пробах. Чтобы установить температуру плавления, пластина нагревается медленно после ПЦР является полным. Как ДНК отдельных, SYBR зеленый выпускается, а сигнал флуоресценции уменьшается. Температура, при которой этот д-рсоч происходит на графике, и известна как температура плавления образца. В зависимости от последовательности ДНК, образцов расплава при различных температурах от друга и от воды отрицательного контроля, которая не должна иметь температуру плавления ДНК, так как не имеется. ПЦР-продукты из каждой пары праймеров должны плавиться при аналогичных температурах. Например, на рисунке 3 показывает анализ кривых плавления для двух разных праймера с использованием того же образца в двух экземплярах. Ясно, что температура плавления различны для двух пар праймеров, но образец тает на точно такую же температуру для каждой репликации. Признаки плохого или потенциально загрязненных выборка может включать несколько пиков плавления, предполагая наличие двух разных источников ввода.
Рисунок 1. Предварительное микроРНК подписей формируются на основе профилирования использованием роман КПЦР массив. Средний deltaCTU6 был рассчитан и стандартизированные значения были загружены в программное обеспечение ArrayMinerTM, уступая 3 различных кластеров отображаются в виде heatmaps. () Предварительно микроРНК с небольшими изменениями в выражении показаны. Предварительно микроРНК, уровни которых значительно снизилась (В) или увеличение (C) также показано на рисунке. Синий соответствует более низким уровнем экспрессии в то время как красный представляет повышенную экспрессию уровнях.
Рисунок 2. Включение внутреннего контроля в КПЦР основе предварительно микроРНК массива. Исходные значения КТ для 3-х различных генов и никакого контроля шаблонов показано на рисунке. U6 используется в качестве внутреннего положительного контроля при ПЦР H2O служит наш отрицательного контроля. Пусть-7а-1-1 является микроРНК обычно выражается в самых разных типах клеток в то время как KSHV LANA может быть использован как положительный или отрицательный контроль, основанный на вирусный статус линии клеток или тканей используются.
Рисунок 3. Пик плавления анализа предварительного микроРНК грунтовки и отсутствие загрязнения образца. Кривые плавления были получены с помощью анализа Tm призвание в LightCycler программного обеспечения. Две разные праймеры (грунтовки и В) для этого же образца работать в двух экземплярах показаны. Температура плавления для каждого грунта различны. Тем не менее, образец имеет только один пик, демонстрируя отсутствие загрязнения образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
КПЦР является высокочувствительным анализа, который может быть использован для сравнения уровней экспрессии генов между образцами в исследовании, а также для определения положительности в случае вирусов. Преимущество использования КПЦР массивов возможность запуска многих праймеров (в нашем случае, 186 пар праймеров) для каждого образца в течение короткого периода времени. Использование пипетки робота, таких как Tecan Свобода Evo, количество времени, необходимое для установки до эксперимента можно еще больше снизить, а точность и согласованность робот может сократить и ликвидировать пипетирования ошибок. Здесь показано, как использовать Tecan Свобода Эво создать микроРНК массива, а также альтернативный метод с использованием матрицы Электронные пипетки Многоканальная, которые могут быть реализованы для лабораторий, которые не имеют доступа к пипетирования робота. КПЦР массивы также полезно, потому что все гены могут быть нормированы на один набор генов ссылки работают на одной пластине, что снижает стоимость и количество реакций.
Как уже упоминалось, Есть несколько ключевых особенностей, которые необходимы при проектировании таких массивов. Так как все пробы на пластину ПЦР будет работать на одинаковых условиях, очень важно, чтобы дизайн праймеров, которые функционируют при тех же температурах и настройки, или какой-либо пары праймеров не удастся. При разработке грунтов, последовательности всегда должны быть проверены BLAST поиска, чтобы гарантировать, что есть гомология к интересующего гена и никаких других генов.
При запуске массива, очень важно, что окружающая среда является стерильной и свободной от загрязнений ПЦР, которые могут привести к ложным срабатываниям. Если это возможно, ПЦР должна быть создана в стерильных капот работы или отдельных чистой комнате, где продукты ПЦР никогда не используются. Скамейки должны быть вымыты с Eliminase, воды и этанола, и подвергается ультрафиолетовому излучению, по крайней мере час после запуска завершена.
Преимуществом этого метода является то, эта же стратегия применима для любого набора генов для профилирования путем простой замены микроРНК массив массив, содержащий другой набор пары праймеров. Наша лаборатория в настоящее время содержит массивы для предварительного микроРНК, KSHV, EBV, p53, и NFkB - все из которых могут быть запущены в идентичных метода представленным. Гибкость этого анализа позволяет нашей лаборатории для выполнения высокой пропускной способностью генов профилирования быстро и надежно для любой пары праймеров, что мы хотим, чтобы экран.
Здесь мы описали массива, используя кДНК из человеческих клеточных линий в профиль уровни микроРНК выражение после активации в течение периода времени. В дополнение к характеризующий клеточные линии, массив может быть также использована для анализа клинических образцов. После выделения РНК, синтеза кДНК может быть выполнена, и кДНК может быть запущен с помощью этого массива для характеристики экспрессии генов. Это может быть полезно для определения вирусной положительность, или профили экспрессии генов для дальнейшей характеризации, какие гены upregulated в образцах из инфицированных пациентов. Таким образом, автоматизированная КПЦР основе массивов воспроизводимых и надежных тестов, которые позволяют очень чувствительны обнаружения различных генов в тканях и клеточных линий в установленные сроки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NIH DE018304, R01DE018281. KT поддерживается T32 GM07092-34 и грантом в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл из Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI) через Med в Град инициативы. ПК поддерживает T32 CA009156.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom Evo 150 | Tecan Group Ltd. | 30017587 | |
| Matrix Electronic Multichannel Pipette | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2001-MTX | (or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above) |
| Matrix Integrity Filter Tips, Sterile | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7435 | (or comparable tip for multichannel used) |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche Group | 04 707 516 001 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Group | 05015243001 | 384-well version |
| Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche Group | 04729749001 | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Group | 04729757001 | |
| LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software | Roche Group | 05075122001 | |
| Eliminase Decontaminant | Decon Laboratories | 04-355-31 |
References
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention. J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).
- O'hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
