Summary
In dit artikel wil beschrijven stapsgewijs de gebruikelijke
Abstract
Schwann-cellen zijn een van de meest gebruikte cellen in reparatie strategieën volgen ruggenmergletsels. Schwann-cellen zijn in staat de ondersteuning van axonale regeneratie en ontspruiten door het afscheiden van groeifactoren 1,2 en het verstrekken van de groei bevorderen van adhesiemoleculen 3 en extracellulaire matrix moleculen 4. Bovendien zijn ze myelinate de gedemyeliniseerde axonen op de site van letsel 5.
Echter na transplantatie, moet Schwann-cellen niet migreren van de site van implantaat en niet vermengen met de gastheer astrocyten 6,7. Dit resulteert in de vorming van een scherpe grens tussen de Schwann-cellen en astrocyten, een obstakel vormt voor het kweken van axonen proberen om het transplantaat weer af te sluiten in de gastheerweefsel proximaal en distaal. Astrocyten in contact met de Schwann-cellen ook ondergaan hypertrofie en up-reguleren van de remmende moleculen 8-13.
In vitro testen zijn gebruikt om het model Schwann cel-astrocyten interacties en zijn belangrijk in het begrijpen van het mechanisme dat ten grondslag de cellulaire gedrag.
Deze in vitro testen omvatten grens assay, waarbij een co-cultuur is gemaakt met behulp van twee verschillende cellen met elk celtype bezettende verschillende gebieden met slechts een kleine kloof tussen de twee fronten cel. Omdat de cellen delen en migreren, de twee mobiele fronten komen dichter bij elkaar en uiteindelijk botsen. Dit maakt het gedrag van de twee mobiele populaties te analyseren aan de grens. Een andere variatie van dezelfde techniek is om de twee mobiele populaties in cultuur mix en na verloop van tijd de twee soorten cellen te scheiden met Schwann-cellen samengeklonterd samen als eilanden in tussen astrocyten samen het creëren van meerdere Schwann-astrocyten grenzen.
De tweede test wordt gebruikt in het bestuderen van de interactie van twee celtypen is de migratie test waar de cellulaire bewegingen kunnen worden gevolgd op het oppervlak van het andere celtype monolaag 14,15. Deze test is algemeen bekend als omgekeerde dekglaasje test. Schwann-cellen worden gekweekt op kleine glasdeeltjes en ze zijn omgekeerd naar beneden op het oppervlak van astrocyte monolagen en migratie wordt beoordeeld vanuit de rand van het dekglaasje.
Beide testen zijn geweest bij het bestuderen van de onderliggende mechanismen die betrokken zijn bij de cellulaire uitsluiting en grens vorming. Een deel van de moleculen geïdentificeerd met behulp van deze technieken zijn N-cadherines 15, chondroïtinesulfaat proteoglycanen (CSPGs) 16,17, FGF / Heparine 18, Ef / Ephrins 19.
In dit artikel wil grens test en migratie test in stapsgewijs te beschrijven en de mogelijke technische problemen die zich kunnen voordoen toe te lichten.
Protocol
1. Boundary Assay:
- Basis bereiding: Kamer dia's zijn voorzien van Poly-D-Lysine 's nachts en steriele glazen dia's worden voorbereid voordat het experiment. Medium wordt bereid met behulp van Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal kalf serum (FCS), en 1% penicilline-streptomycine-Fungizon (PSF). Ook een fles van Calcium / Magnesium gratis Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) is bereid.
- Primaire rat Schwann-cellen gekweekt in kolf zijn getrypsiniseerd gedurende 3 minuten met 0,1% trypsine. Primaire rat astrocyten cultuur is getrypsiniseerd gedurende 5 minuten met 0,1% trypsine.
Trypsine is inactived door het toevoegen van DMEM aangevuld met 10% FCS en 1% PSF. - Getrypsiniseerd Schwann-cellen en astrocyten zijn overgebracht naar 15 ml Falcon buizen gescheiden en gecentrifugeerd bij 300G gedurende 5 minuten.
- Schwann cellen en astrocyten opnieuw worden geschorst op de dichtheid van 2 x 10 6 (zie de representatieve resultaten sectie voor variaties in de celdichtheid).
- 50 pi daling van Schwann celsuspensie wordt geplaatst aan de ene kant van de PDL-gecoate kamer slide putten. Een glazen strook werd gebruikt om smeren de druppel naar het midden van de kamer naar een rechte rand te genereren. (Met behulp van een glassnijder, een rechthoekige glazen dekglaasjes overlangs gesneden, zodat dat het de breedte van de kamer slides gebruikt voor de grens assays fit)
- Een tweede daling van 50 ul van astrocyten suspensie werd geplaatst aan de andere kant van dezelfde goed en gesmeerd naar het centrum om een rechte rand parallel aan de eerste druppel uitstrijkje met een kleine 0,2 mm kloof tussen hen te creëren.
- De kamer dia's met daarin de druppels worden geplaatst in de incubator bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- Na 2 uur, werden de kweken gewassen met DMEM aan niet-ingeschreven cellulaire puin en vers medium met DMEM / 10% FCS / 1% PSF toegevoegd te verwijderen.
Let op: DMEM / 10% FCS / 1% PSF kan worden aangevuld met forskoline (2μM) en Bovine hypofyse extract (BPE) (10μg / mL) te stimuleren Schwann cel proliferatie. BPE levert de groeifactoren die nodig zijn om op lange termijn Schwann cel cultuur toe te staan en forskoline verhoogt de cyclische adenosine monofosfaat niveaus binnen de Schwann-cellen te induceren proliferatie - Cellen worden gekweekt voor ongeveer 8-10 dagen bij 37 ° C, 7% CO 2 incubator. Het medium moet vervangen worden om de 3 dagen. De twee cel fronten zal uiteindelijk elkaar en een scherpe grens vormen tussen de twee celtypen. In dit stadium experimenten kan worden uitgevoerd analyseren van factoren die betrokken zijn bij grens formatie.
- Co-cultuur kan worden bevestigd met 4% formaldehyde en Schwann-cellen kunnen worden immunostained met anti-P75 antilichaam en astrocyten met anti-GFAP antilichamen tegen de cellen te identificeren in co-cultuur. P75 antilichaam herkent een lage affiniteit NGF receptor op Schwann cellen die astrocyten missen. Anti-GFAP antilichaam herkent gliale firbrillary zure eiwit dat lokaliseert tot astrocyten cytoplasma. (Zie figuur 1A voor representatieve grens)
2. Migratie Assay:
- 4 well platen (15mm putten) zijn PDL gecoat 's nachts en voorbereid voor het creëren van astrocyten monolagen.
- Primaire astrocyten cultuur is getrypsiniseerd gedurende 5 minuten met 0,1% trypsine. Trypsine wordt geïnactiveerd door het toevoegen van DMEM aangevuld met 10% FCS en 1% PSF en cel gecentrifugeerd bij 300G gedurende 5 minuten. (Zie figuur 2)
- Astrocyten opnieuw geschorst op 1x10 5 cellen / ml. 1 ml van deze oplossing wordt toegevoegd aan elk PDL gecoat goed in 4 well platen. Astrocyten worden gekweekt voor 24-48 uur totdat de monolaag is volledig confluent.
- Om Schwann cel migratie te beoordelen op astrocyten monolagen, parallel aan het creëren van astrocyten monolagen, ronde PDL-gecoat glas dekglaasjes worden geplaatst in een 50 mL buis en geplet met behulp van een plastic pipet om kleine stukjes glas te creëren.
- Glasscherven worden overgebracht in een put in 6 wells plaat schaal en het gebruik van een tang met aangepaste afmetingen fragmenten worden gekozen en geplaatst in andere putten. 5 glazen fragmenten worden geplaatst in elk putje in 6 well platen.
- Primaire Schwann-cellen gekweekt in kolf zijn getrypsiniseerd gedurende 3 minuten met 0,1% trypsine. Getrypsiniseerd Schwann-cellen worden overgebracht naar 15 ml Falcon buis gescheiden en gecentrifugeerd bij 300 G gedurende 5 minuten. Schwann-cellen worden opnieuw geschorst op 2x 10 6 cellen / ml in DMEM/10% FCS / 1% PSF.
- 20 pi druppels van Schwann-cellen suspensie wordt toegevoegd over elke 5 dekglaasje fragmenten geplaatst in zes goed platen en cellen worden geïncubeerd bij 37 ° C, 7% CO 2 gedurende 2 uur.
- Na 2 uur worden de Schwann-cellen aan de dekglaasje fragmenten en DMEM/10% FCS / 1% PSF (aangevuld met 2μM van Forskolin en 10μg / mL van BPE wordt aan elk putje toegevoegd, zodat de fragmenten volledig bedekt zijn met medium) .
- De 6 well platen met de fragmenten worden dan geplaatst in de incubator voor 24-48 uur totdat het glas fragmenten zijn volledig convloeiend met Schwann-cellen.
- Zodra fragmenten zijn samenvloeiing met Schwann-cellen, wordt elk fragment opgehaald voorzichtig met scherpe pincet en ondergedompeld in HBSS met losse cellen te verwijderen en vervolgens omgekeerd naar beneden op astrocyten monolaag.
- Elke well wordt dan bedekt met een ml DMEM/10% FCS / 1% PSF en Schwann-cellen mogen migreren gedurende 24 tot 48 periode. Tijdens deze periode experimentele reagentia zoals groeifactoren kunnen worden toegevoegd om het effect te beoordelen op het aantal en de afstand van de migratie van de Schwann-cellen.
- Na de migratie periode, zijn de glasscherven bevestigd aan de onderkant van elke goed door de toevoeging van 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 30 minuten. Na fixatie, immunostain de Schwann-cellen voor p75 (herkennen van lage affiniteit NGF-receptor) dan vlek ze met behulp van ABC strepavidin kit-diaminobenzidine (DAB), om visualisatie van de Schwann-cellen onder de lichtmicroscoop mogelijk te maken.
3. Representatieve resultaten:
Na 8-10 dagen Schwann-astrocyten co-culturen tonen een scherpe grens tussen de twee celtypen. Deze grens is meer uitgesproken als forskoline en BPE wordt gebruikt in de cultuur als Schwann cel proliferatie is verbeterd.
Als er geen grens is waargenomen tijdens de periode van 10 dagen, kan de tijd van de cultuur verder worden verhoogd totdat de grenzen zijn vastgesteld. Het veranderen van de verhouding van de celdichtheid is een alternatieve manier om de grens formatie te verhogen. Een verhouding van 3:1 Schwann: astrocyten celdichtheid kan worden gebruikt bij het opstellen van celsuspensies 8,18.
Naar aanleiding van immunokleuring van de Schwann-cellen en astrocyten te identificeren, tot cel vermenging een lijn kan worden getrokken waar de grens is gevestigd en het aantal Schwann-cellen migreren naar het astrocyt grondgebied kan worden geteld onder de fluorescentie microscoop te beoordelen.
Hieronder staan twee voorbeelden van beelden verkregen grenzen, een met goed gevormde segregatie van Schwann cellen en astrocyten (Figuur 1A) en een waar de cellen niet goed gescheiden in verschillende gebieden te wijten aan een slechte techniek (Figuur 1B).
. Figuur 1 Boundary test: Schwann-astrocyten interactie. A) Een 10 dagen co-cultuur assay in de aanwezigheid van forskoline en BPE aan Schwann cel proliferatie te stimuleren geeft blijk van een scherpe grens tussen de twee celtypes (rood = P75, groen = GFAP). B) Een 10 dagen co-cultuur assay waar de grens niet is gevormd en de twee cel fronten gemengd. Dit was te wijten aan het mengen van de twee druppeltjes bij het plaatsen van astrocyten en Schwann cel druppels naast elkaar tijdens de voorbereiding van de grens (rood = P75, groen = GFAP).
Figuur 2. Representatief beeld van samenvloeiende astrocyte monolaag
Migratie testen beoordelen beweging van een celtype over het oppervlak van een ander celtype en daarom beoordelen van een ander fenomeen dan die van grens formatie.
De praktijk is nodig om het omkeren van de dekglaasjes op monolagen zorgen niet leidt tot schade aan de Schwann cel bedekte glas fragmenten en astrocyte monolagen door de scherpe tang. Om de migratie van Schwann-cellen, de maximale afstand van de migratie en het aantal migrerende cellen van de rand van dekglaasje kan worden gemeten onder lichtmicroscoop.
Hieronder is het beeld van Schwann-cellen gekleurd met P75 antilichaam via DAB vlekken op het oppervlak van astrocyte monolaag (figuur 3).
Figuur 3. Migratie test met behulp van omgekeerde dekglaasje test. A) Schwann-cellen (bruin, immunostained met p75 antilichaam) migratie uit de buurt van de rand van het dekglaasje. Pijl wijst naar de richting van de cel migratie uit de buurt van het dekglaasje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De assays hierboven beschreven zijn die in verschillende studies het aantonen van de rol van meerdere factoren betrokken bij de vorming grens tussen de Schwann-astrocyten en beperkte Schwann cel migratie in astrocytaire omgeving.
Inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze gebeurtenissen is essentieel omdat het in staat zou stellen de ontwikkeling van strategieën voor het optimaliseren en verbeteren van de integratie van Schwann cel transplantatie na de transplantatie en zo gemakkelijker de uitgang van de regenererende axonen van het transplantaat terug in de gastheerweefsel waardoor de vorming van de verbindingen met de gastheer weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag Philippa Warren bedanken voor haar soort te helpen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | |
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | |
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | |
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344273 | |
| Coverlips | VWR international | 631-0149 | |
| Coverlips(rectangle) | Menzel-Glaser | BB022050A1 | |
| Chamber slides | Nalge Nunc international | 177380 | |
| 4 well plates, 6 well plates | Nalge Nunc international | 4 well plates6 well plates | |
| rat p75 antibody | EMD Millipore | MAB365 | |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | |
| Secondary antibodies (Alexa-conjugated) | Invitrogen | A-11004 A-11034 | Goat anti mouse 568Goat anti Rabbit 488 |
| Secondary biotinylated | Vector Laboratories | Goat anti mouse | |
| DAB tablets | Sigma-Aldrich | D4418 | |
| ABC elite kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6168 | |
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
References
- Assouline, J. G. Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors. Brain Res. 428, 103-118 (1987).
- Taylor, J. S., Bampton, E. T. Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells. J Anat. 204, 25-31 (2004).
- Reichardt, L. F. Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces. Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).
- Chiu, A. Y., Monteros,, Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture. Glia. 4, 11-24 (1991).
- Blakemore, W. F. Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve. Nature. 266, 68-69 (1977).
- Andrews, M. R., Stelzner, D. J. Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord. J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).
- Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival. Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter. Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Astrocyte-Schwann cell interactions in culture. Glia. 11, 367-377 (1994).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures. Glia. 14, 145-152 (1995).
- Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface. Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).
- Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord. Brain Res. 277, 175-180 (1983).
- Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells. Dev Biol. 171, 1-15 (1995).
- Wilby, M. J. N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes. Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).
- Grimpe, B. The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces. Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced. Glia. , (2010).
- Santos-Silva, A. FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis. J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling. J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).
