Summary
Bu makale niyetinde kademeli biçimde tanımlamak için yaygın olarak kullanılan
Abstract
Schwann hücreleri, omurilik yaralanması sonrasında onarım stratejileri yaygın olarak kullanılan hücre biridir. Schwann hücreleri, aksonal rejenerasyon salgılayan büyüme faktörleri 1,2 destekleyen ve çimlenme ve büyümeyi teşvik adezyon molekülleri 3 ve ekstraselüler matriks molekülleri 4 sağlayarak yeteneğine sahiptir . Buna ek olarak 5 yaralanma yerinde demyelinated aksonlar myelinate.
Ancak, Schwann hücrelerinin nakli aşağıdaki implant sitesinden göç yoktur ve ev sahibi astrositler 6,7 ile karışmaz. Bu sonuç, Schwann hücreleri ve astrosit arasında keskin bir sınır oluşumu proksimale ve distale ana dokusu içine greft arka çıkmak için çalışıyor büyüyen aksonlar için bir engel oluşturmak. Schwann hücreleri ile temas Astrositler da hipertrofisi geçmesi ve inhibitör molekülleri 8-13 up-regüle.
In vitro tayinlerde modeli Schwann hücre astrosit etkileşimleri kullanılmış olan ve hücresel davranışın altında yatan mekanizma anlaşılmasında önemli olmuştur.
In vitro tayinlerde Bu sınır tayini, bir ko-kültür, sadece küçük bir boşluk iki hücre cephede ayıran farklı toprakları işgal her hücre tipi ile iki farklı hücre kullanılarak yapılır . Hücrelere bölmek ve göç gibi, hücresel iki cephede birbirlerine yakın ve nihayet çarpışır olsun. Bu davranış sınırında analiz edilecek iki hücre popülasyonlarının sağlar. Aynı tekniğin başka bir varyasyonu iki hücre popülasyonları kültür karışımı ve zamanla iki hücre tipleri ayırınız Schwann hücreleri ile birlikte birden fazla Schwann astrosit sınırları astrositler arasındaki adalar olarak bir araya clumped.
Iki hücre tipleri etkileşim eğitim kullanılan ikinci tahlil, hücresel hareketi diğer hücre tipi tek tabaka 14,15 yüzey üzerinde takip edilebilir göç testtir . Bu testte ters lamel testinin yaygın olarak bilinir. Schwann hücreleri, küçük cam parçaları üzerinde kültür ve astrosit mono tabakaları yüzey üzerine yüzü aşağı gelecek şekilde ters düz ve göç lamel kenarında değerlendirilir.
Her iki deneyleri hücresel dışlanma ve sınır oluşum yer altında yatan mekanizmaları inceleyerek etkili olmuştur. Bazı moleküllerin bu teknikleri N-Cadherins 15, Kondroitin Sülfat proteoglikanların (CSPGs) 16,17, FGF / Heparin 18, Efesliler / Ephrins 19 kullanılarak belirlendi.
Bu makale, kademeli moda sınır tahlil ve göç tahlil tanımlamak ve meydana gelebilecek olası teknik sorunları aydınlatmak için niyetindedir.
Protocol
1. Sınır Testi:
- Temel hazırlık: Poly-D-Lizin gecelik ve steril cam slaytlar Odası slaytlar ile kaplı, deney başlamadan önce hazırlanır. Orta Dulbecco'nun Modifiye Kartal,% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ile desteklenmiş Orta (DMEM), ve% 1 Penisilin-Streptomisin-Fungizon (PSF) kullanılarak hazırlanmıştır. Ayrıca kalsiyum / magnezyum ücretsiz Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) bir şişe hazırlanmıştır.
- Cam şişe içinde kültür İlköğretim sıçan Schwann hücrelerinin% 0.1 tripsin kullanarak 3 dakika tripsinize. İlköğretim sıçan astrosit kültür,% 0.1 'lik tripsin kullanarak 5 dakika tripsinize.
Tripsin DMEM ekleyerek% 10 FCS ve 1% PSF ile desteklenmiş aktif değil. - Tripsinize Schwann hücreleri ve astrositler, 15 ml şahin tüpler ayrı aktarılır ve 300G 5 dakika santrifüj.
- Schwann hücreleri ve astrositler (hücre yoğunluğu varyasyonları temsilcisi sonuçlar bölümüne bakınız) 2 x 10 6 yoğunlukta yeniden askıya alınır.
- Schwann hücre süspansiyonu 50 mcL damla PDL kaplı oda slayt kuyuların bir ucunda yer alır. Bir cam şeridi düz bir kenar oluşturmak için odanın ortasına doğru açılan smear kullanılmıştır. (Cam kesici kullanarak, dikdörtgen bir cam lamelleri sınır deneyleri için kullanılan odasına slaytlar genişliği uygun olacağını boyuna kadar kesilir)
- Astrosit süspansiyon 50 mcL ikinci bir damla yerleştirilir ve aynı sıra ters sonunda, aralarında küçük bir 0.2mm boşluk ile ilk damla smear paralel düz bir kenar oluşturmak için merkeze doğru bulaşmış oldu.
- Odasına damla 37 inkübatöre yerleştirilir ° C'de 2 saat süreyle içeren slaytlar.
- 2 saat sonra, kültürler bağlı olmayan hücresel enkaz kaldırmak için ve taze orta DMEM /% 10% FCS / 1 PSF eklendi içeren DMEM ile yıkandı.
Not: DMEM /% 10 FCS /% 1 PSF forskolin (2μM) ve Sığır hipofiz ekstresi (BPE) (10μg / ml) Schwann hücre proliferasyonu uyaran ile takviye edilebilir. BPE, uzun vadeli Schwann hücre kültürü izin için gerekli olan büyüme faktörleri tedarik edecek ve forskolin proliferasyonunu uyardığı Schwann hücre içindeki siklik adenozin monofosfat düzeylerini artırmaktadır. - Hücreler 8-10 gün boyunca yaklaşık 37 ° C,% 7 CO 2 inkübatör kültür. Orta 3 günde bir değiştirilmesi gereklidir. Iki hücre cephede sonunda birbirlerine ulaşacak ve iki hücre tipleri arasında keskin bir sınır oluşturacak. Bu aşamada deneyler sınır oluşum katılan faktörler analiz yapılabilir.
- Ko-kültür,% 4 formaldehit ve Schwann hücreleri, ko-kültür hücreleri tanımlamak için anti-P75 antikor ve anti-GFAP antikorları astrositler ile boyanmış olabilir ile tespit edilebilir. P75 antikor astrositler eksikliği Schwann hücreleri üzerinde düşük afinite NGF reseptör tanır. Anti-GFAP antikor astrosit sitoplazmasında lokalize glial firbrillary asidik protein tanır. (Bkz. Şekil 1A temsilcisi sınır)
2. Göç Testi:
- 4 tane iyi plakalar (15mm kuyu) PDL kaplı gecelik ve astrosit mono tabakaları oluşturmak için hazırlanmıştır.
- İlköğretim astrosit kültür,% 0.1 'lik tripsin kullanarak 5 dakika tripsinize. Tripsin DMEM% 10 FCS ve% 1 PSF ve 300G az 5 dakika santrifüj hücre ile desteklenmiş ekleyerek inaktive olur. (Bakınız Şekil 2)
- Astrositler 1x10 5 hücre / ml tekrar askıya alınır. Bu çözeltinin 1 ml 4 kuyucuğu her PDL kaplamalı eklenir. Tek tabaka tamamen konfluent kadar Astrositler 24-48 saat kültüre.
- Paralel, dairesel PDL kaplı cam lamelleri 50 ml tüp yerleştirilir ve küçük cam parçaları oluşturmak için plastik bir pipet kullanarak ezilmiş astrosit mono tabakaları oluşturmak için, astrosit mono tabakaları Schwann hücre göçü değerlendirmek için.
- Cam parçaları 6 plaka çanağı bir kuyunun içine transfer edilir ve büyüklükteki parçaları uygun bir forseps kullanılarak seçilen ve diğer kuyularda yerleştirilir. 6 kuyucuğu her kuyuda 5 cam parçaları yerleştirilir.
- Cam şişe içinde kültür İlköğretim Schwann hücrelerinin% 0.1 tripsin kullanarak 3 dakika tripsinize. Tripsinize Schwann hücreleri, 15 ml şahin tüp ayrı transfer ve 300 G 5 dakika santrifüj. Schwann hücreleri DMEM/10% FCS / 1% PSF 2x 10 6 hücre / mL yeniden askıya alınır.
- Schwann hücrelerinin süspansiyon 20 mcL damlacıkları, 6 kuyu plakaları ve hücreleri yerleştirilen her 5 lamel parçalarının 37 ° C,% 7 2 saat boyunca CO 2 inkübe üzerine eklenir .
- 2 saat sonra, Schwann hücreleri lamel parçaları eklenir ve DMEM/10% FCS /% 1 PSF (forskolin ve 10μg / mL BPE 2μM içerir parçaları tamamen orta ile kaplıdır, böylece her bir kuyunun eklenir) .
- Cam parçaları tamamen con kadar parçaları içeren 6 kuyucuğu 24-48 saat sonra inkübatöre yerleştirilir.Schwann hücreleri ile bilmektedir.
- Bir kez parçaları Schwann hücreleri ile konfluent, her parça dikkatlice keskin forseps kullanarak kaldırdı ve astrosit tek tabaka üzerinde ters yüz aşağı sonra unattached hücreleri çıkarmak ve HBSS batırılmış.
- Her kuyu sonra 1 mL% FCS / 1% PSF ve Schwann hücreleri 24 - 48 dönem için göç etmeye izin verilir DMEM/10 ile kaplıdır. Bu dönemde büyüme faktörleri gibi deneysel reaktifler, Schwann hücrelerinin göç sayısı ve mesafe üzerindeki etkileri değerlendirmek için eklenebilir.
- Geçiş dönemini takiben, cam parçaları, 30 dakika için% 4 paraformaldehid (PFA) ekleyerek her bir kuyunun dibine sabitlenir. Aşağıdaki fiksasyon, P75 Schwann hücreleri (düşük afinite NGF reseptör tanıma), ardından ABC strepavidin kiti-diaminobenzidin (DAB) kullanarak bunları leke Schwann hücrelerinin ışık mikroskobu altında görselleştirme izin immunostain.
3. Temsilcisi Sonuçlar:
Schwann astrosit ortak kültürler, 8-10 gün sonra iki hücre tipleri arasında keskin bir sınır göstermektedir. Bu sınır, Schwann hücre proliferasyonu gelişmiş forskolin ve BPE kültür kullanılırsa daha belirgindir.
Hiçbir sınır 10 günlük süre içinde görülürse, sınırları kuruluncaya kadar, kültür zaman daha da artmaktadır. Hücre yoğunluğu oranının değiştirilmesi sınır oluşumunu arttırmak için alternatif bir yol. 03:01 Schwann oranı: hücre süspansiyonları 8,18 hazırlarken astrosit hücre yoğunluğunda kullanılabilir.
Schwann hücreleri ve astrositler belirlemek için sınır kurulmuş olduğu bir çizgi çizilebilir astrosit topraklarına göç Schwann hücrelerinin sayısı ve floresan mikroskop altında sayılabilir karışmasının hücre değerlendirmek için, immün ardından.
Aşağıda, elde edilen görüntüleri iki örnek sınırları, Schwann hücreleri ve astrositler (Şekil 1A) ve hücrelerin, zayıf tekniği (Şekil 1B) nedeniyle farklı toprakları içine de ayrı ayrı değil bir iyi biçimli segregasyon bir.
Şekil 1: Sınır tahlil: Schwann astrosit etkileşim. Schwann hücre proliferasyonu uyarmak için forskolin ve BPE varlığı A) 10 gün co-kültür tahlil, iki hücre tipleri (kırmızı = P75, yeşil = GFAP) arasında keskin bir sınır göstermektedir. B) 10 günlük sınır oluşturduğu bir ortak kültür tahlil ve iki hücre cephede karıştırılır. (Kırmızı = P75, yeşil = GFAP) sınır hazırlanması sırasında birbirlerine sonraki astrosit ve Schwann hücresi damlacıkları yerleştirerek Bu iki damlacıklarının karıştırma nedeniyle oldu.
Şekil 2 konfluent astrosit tek tabaka Temsilcisi görüntü
Göç testleri yüzey üzerinde başka bir hücre tipi, tek bir hücre tipi hareketi değerlendirmek ve bu nedenle sınır oluşum farklı bir fenomen değerlendirmek.
Uygulama mono tabakaları üzerine tersini lamelleri sağlamak için gerekli olan Schwann hücre, keskin forseps cam parçaları ve astrosit mono tabakaları kaplı. Zarar yol açmaz Schwann hücreleri, maksimum mesafe göç ve lamel kenarına göç hücrelerinin sayısı göç değerlendirmek için ışık mikroskobu altında ölçülebilir.
Aşağıda astrosit tek tabaka yüzeyinde (Şekil 3) DAB boyama P75 antikor ile boyandı Schwann hücrelerinin görüntü.
Şekil 3 ters lamel assay kullanarak Göç tahlil. A) Schwann hücresi (kahverengi, P75 antikor ile boyanmış) lamel kenarından uzak göç. Ok lamel uzak hücre göç yönüne işaret eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda anlatılan testlerin Schwann astrositler ve astrositik ortamda sınırlı Schwann hücre göçü arasındaki sınır oluşumu dahil çoklu faktörlerin rolünü gösteren çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır.
Stratejilerinin geliştirilmesi optimize etmek için izin ve Schwann hücre greft transplantasyonu takip entegrasyonu geliştirmek ve bunu yaparken de yenileyici aksonlar sağlayan ana dokusu içine greft arka çıkış kolaylaştırmak olduğu gibi bu olayların altında yatan mekanizmaların anlaşılması şarttır bağlantıları oluşumu ana dokusu ile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Philippa Warren Biz onu türlü yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | |
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | |
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | |
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344273 | |
| Coverlips | VWR international | 631-0149 | |
| Coverlips(rectangle) | Menzel-Glaser | BB022050A1 | |
| Chamber slides | Nalge Nunc international | 177380 | |
| 4 well plates, 6 well plates | Nalge Nunc international | 4 well plates6 well plates | |
| rat p75 antibody | EMD Millipore | MAB365 | |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | |
| Secondary antibodies (Alexa-conjugated) | Invitrogen | A-11004 A-11034 | Goat anti mouse 568Goat anti Rabbit 488 |
| Secondary biotinylated | Vector Laboratories | Goat anti mouse | |
| DAB tablets | Sigma-Aldrich | D4418 | |
| ABC elite kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6168 | |
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
References
- Assouline, J. G. Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors. Brain Res. 428, 103-118 (1987).
- Taylor, J. S., Bampton, E. T. Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells. J Anat. 204, 25-31 (2004).
- Reichardt, L. F. Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces. Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).
- Chiu, A. Y., Monteros,, Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture. Glia. 4, 11-24 (1991).
- Blakemore, W. F. Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve. Nature. 266, 68-69 (1977).
- Andrews, M. R., Stelzner, D. J. Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord. J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).
- Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival. Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter. Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Astrocyte-Schwann cell interactions in culture. Glia. 11, 367-377 (1994).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures. Glia. 14, 145-152 (1995).
- Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface. Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).
- Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord. Brain Res. 277, 175-180 (1983).
- Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells. Dev Biol. 171, 1-15 (1995).
- Wilby, M. J. N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes. Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).
- Grimpe, B. The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces. Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced. Glia. , (2010).
- Santos-Silva, A. FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis. J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling. J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).
