Summary
特発性疾患における適応免疫の微生物のターゲットの同定、酵素結合immunospotアッセイの使用により達成することができます。
Abstract
適応免疫は、細胞内病原体のクリアランスに重要なコンポーネントです。ヒトではこれらの応答を検出し、定量化する能力は重要な診断ツールです。酵素結合immunospotアッセイ（ELISPOT）は、HIV感染、移植患者など免疫抑制集団、およびステロイドの使用を含む、微生物抗原に対して細胞性免疫応答を識別する能力のため人気を集めている。このアッセイは、特定の微生物の抗原に対する免疫応答を定量化する能力を有し、同様にこれらの応答がTh1または文字のTh2のかどうか区別する。 ELISPOTは、炎症部位に限定されるものではない。それは、末梢血、だけでなく、気管支肺胞洗浄液、脳脊髄液、腹水など、積極的な関与のサイト内での免疫応答のために評価する能力に汎用性があります。単一または複数の抗原に対する免疫応答の検出が可能であるだけでなく、微生物のタンパク質内の特定のエピトープ。このアッセイは、時間の経過とともに免疫応答の検出だけでなく、ホストのT細胞が認識する抗原の違いを容易にします。デュアルカラーELISPOTアッセイは、2つのサイトカインの同時発現の検出のために用意されています。このテクニックのための最近のアプリケーションは、肺外結核の診断だけでなく、自己免疫疾患に感染抗原の寄与の検討が含まれています。
Protocol
次のプロトコルの場合、我々は目的の細胞として末梢血単核細胞（PBMC）を使用します。しかし、このプロトコルは、他の細胞型で使用できます。無菌操作を用いて組織培養フードのアッセイを実行します。
1日目：プレートと細胞の作製
- ELISPOTプレートを取り出し、フードで開きます。
- 可能な場合、そうでない場合は、単一のよくピペッティングが許容される、マルチチャンネルピペッターを使用して1 × PBS 150μLでプレートを3回洗浄。
- 貯水池のパッケージを取り出し、フードで開きます。
- 濃度2μg/ mLの捕捉抗体の、抗ヒトインターフェロン-γ、11〜1 × PBSのMLS。を追加よく渦。貯水池への抗体のミックスを転送する。
- マルチチャンネルを使用して各ウェルにコーティング溶液の代わりに100μL。
- パラフィルムでプレートを包みます。
- 一晩冷蔵庫にプレートを置きます。プレートは、週に適しています。経験則では、井戸の液体左がまだ存在する場合、プレートを使用できることです。
細胞の準備
末梢血単核細胞が新鮮な場合はその後37℃で細胞をカウントし、一晩インキュベート° Cを5％CO 2で。液体窒素に保存されたPBMCの場合、細胞の凍結融解することが必要です。次のようにプロトコルは、次のとおりです。
- ほぼ完全に融解するまで37でのセルのクライオバイアル℃の水浴を解凍。
- すぐにR10メディア5mLに懸濁します。
- 225 × gで5分間スピン
- R10メディア5mLに再び懸濁し、トリパンブルーを用いて生細胞を数える。
- R10メディアに2 × 10 6細胞/ mLに濃縮をもたらす。
- ° C、5％CO 2で一晩37休憩。
2日目：設定アッププレート
- 検体の識別番号、うまく条件、および日付とラベルのプレートのふた。
- ダンプとブロット法を用いて滅菌1X PBSを150μLでプレートを6回洗浄する。ダンプしながらプレートを飛散しないように注意してください。これはプレートのウェルが紫にする可能性があります。
- 各ウェルにR20 100μLを加える。
- 37プレート℃で1時間インキュベートします。
- プレートがインキュベートされている間、一晩休息された細胞を数える。
- 5分間1500rpmで細胞懸濁液をスピン。上清をデカントし、R10メディアに1mLの当たり1X10 6細胞の最終濃度を持つようにペレットを再懸濁します。
- 1時間のインキュベーションの後、R20ダンプとブロット法を用いて取り除く。ダンプしながらプレートを飛散しないように注意してください。
- 各ウェルに細胞溶液100μL（10 5細胞）を追加します。重複しての対応するウェルに適切なペプチドおよび/または抗原を追加。新しいピペットチップ、あなたがペプチドワーキング溶液中に行くたびに使用してください。通常のペプチドの濃度は10〜40μg/ mLとなります。ペプチドが異なるため、各研究者が最適な結果を得るためにペプチドを滴定してください。
- ネガティブコントロールウェルでは、セルだけを（無ペプチド）を追加
- ポジティブコントロールウェルでは、フィトヘマグルチニンを（、10μg/ mLの、シグマPHA）を追加。
- 37℃で一晩インキュベート° C、5％CO 2（〜18時間）。
3日目：プレートの開発
- ダンプとブロット法を用いて150μL1xPBSでプレートを6回洗浄する。
- マルチチャンネルピペッターを使用してプレートの各ウェルに100μLのPBSを追加。
- 15分間冷蔵庫にプレートを置く。
- 冷蔵庫の外板を取り出し、組織培養フードに入れてください。
- ビオチン抗体溶液を準備する
- 11mL PBSにビオチンの抗体0.5μg/ mLの（MAB 7 - B6 - 1）を追加します。
- 渦うまくミックスするソリューション。
- マルチチャンネルを使用してソリューションを追加することを計画している場合、貯水池にそれを注ぐ。
- くずかごにそれをフリックでPBSを捨ててください。ダンプしながらプレートを飛散しないように注意してください。
- 各ウェルに溶液100μLを置きます。
- 1時間室温で組織培養フードにプレートをインキュベートする。
- ダンプとブロット法を用いて150μL1xPBSでプレートを6回洗浄する。あなたがストレプトアビジン抗体を準備するまで6 回の洗浄では、プレートにPBSを残す。
- ストレプトアビジン抗体を準備します。
- 11mL PBS（1:2000希釈）、5.5μlのストレプトアビジン抗体（ストレプトアビジン- ALP）を追加します。
- 渦うまくミックスするソリューション。
- マルチチャンネルを使用してソリューションを追加することを計画している場合、貯水池にそれを注ぐ。
- プレートに残ったPBSを捨て、プレートを覆い隠す。
- 各ウェルにストレプトアビジン溶液100μLを加える。
- 1時間室温で組織培養フードにプレートをインキュベートする。
- PBSは、ダンプとブロット法を用いてプレートを6回洗浄する。あなたが色のソリューションを確保するまでの6 番目の洗浄では、プレートにPBSを残す。
- 暗闇の中で働く。アルカリホスファターゼの基質溶液（アルカリフォスファターゼ基質キットIV BCIP / NBT）を準備します。
- 基質試薬1〜11 mLのトリス緩衝液、よく渦の4滴を追加します。トリス緩衝液、よくボルテックスする基質試薬2の4滴を追加します。トリス緩衝液、よくボルテックスする基質試薬3の4滴を追加します。
- 残りのPBSを捨て、プレートを覆い隠す。
- マルチチャンネルを使用してプレートの各ウェルに色溶液100μLを加える。
- 発色の5〜10分後にライトをオンにします。
- スポットがパープルに変わり始めるとかなり暗くなるまで、色試薬はプレートにしておくことができます。これは、5〜20分くらいかかりますがあります。そうする高いバックグラウンドを引き起こす可能性があるため長すぎるの基質溶液を残さないように注意してください。
- 水道水でELISPOTプレートを3回洗浄。
- 約時間または一晩乾燥さおきます。
- 手動またはELISPOTプレートリーダーでプレートをお読みください。
- 露光から離れボックスでプレートを保管してください。
代表的な結果：
ELISPOTは、微生物抗原に対する免疫応答を定量化するために設計されています。各スポットには、興味のあるサイトカインを表現する、単一の応答性細胞を示している。スポットは、手動またはELISPOTプレートリーダーを使用してカウントすることができます。
ELISPOTが正しく行われていることを評価に関心のサイトカインの背景に生産のための陰性対照の調査から始める必要があります。少し背景（紫色）が存在する可能性はありますがネガティブコントロールウェルでは、1つは、ないのスポットを表示しないことを期待する。一般的に、よくあたり5箇所の平均よりも小さいがあるはずです。ポジティブコントロールのウェルは、反応が正しく行われていること、および細胞が抗原刺激に応答することを確認してください。ポジティブコントロールウェルでは、スポット（Fig1）の合流により、深い紫色の背景を見ることが期待される。ない白い背景はほとんどないはずです。ポジティブコントロールとネガティブコントロールサンプルが適切である場合、一つは、目的の抗原を含むウェルをカウントできます。 "次善の"結果は、高バックグラウンド（井戸は紫）、無斑または非常に少数の斑点、ブランクセンター、不十分な定義スポットまたはコンフルエントスポットが反映されます。トラブルシューティングのヒントのリストは、（表1）提供されています。
図1。ELISPOTプレートの代表。各プレートは2つのウェル内で最低で行われたポジティブコントロール、ネガティブコントロールと目的のペプチドが含まれている必要があります。深い紫色、コンフルエント細胞とほとんどない白色の背景があるかあなたが見ることができるようにC9、C10、D9とD10は、陽性コントロールウェルです。ネガティブコントロールのウェルは、G11、G12、H11とH12です。これらの井戸は紫色の背景と、期待どおりのないスポットがありません。スポットG7、G8、H7やH8は、微生物ペプチドに対する細胞応答を示し、紫色の斑点は、関心のサイトカインを発現している単一の応答性細胞を表しています。
表1
| 観測 | 可能な問題 | 考えられる解決方法 |
| 高いバックグラウンド | 1。膜の両側には、適切に洗浄しない 2。あまりにも多くの細胞が分泌するサイトカイン 3。プレートは、適切に乾燥しない 4。開発したプレート上に | 1。発色の前と後の蒸留水で膜の両面を洗います。試薬は、プレートの底に膜を介して漏洩する可能性があります、と洗い流されていない場合は、これらは、高いバックグラウンドを引き起こす可能性があります。 2。ウェルあたりの細胞数を減らす、これは最適化が必要になります 3。読む前にプレート長く乾燥させる 4。開発時間を短縮 |
| いいえスポットなし/非常に少数のスポット | 1。興味のない十分な細胞が分泌するサイトカイン/タンパク質 2。細胞が正しく刺激されていることを確認 3。 lを格納するためにインキュベートしていない細胞十分なオングや刺激への応答に時間がかかることがあります 4。不十分な発色 5。十分な一次または二次抗体 | 1。セルの数を増やします。これは、最適化が必要になります 2。また、正の刺激のコントロールを使用してください - あなたが知っている興奮剤は、目的のサイトカイン/タンパク質の発現を誘導する 3。細胞のインキュベーション時間を増やすか、または間接的な方法を（覚せい剤による前御馳走細胞）を使用してください 4。オーバーヘッド顕微鏡で発色を監視し、開発する試薬が正しく保存されていると活性を失っていないことを確認してください 5。プライマリおよび/または二次抗体の濃度が増加する必要があります。これは、最適化が必要になります。 |
| ブランクエリア | 1。膜前処理ではない 2。膜は、いくつかの段階で乾いている 3。細胞が偏在 | 1。膜は、70％エタノール（すべての膜はこのようにあなたのサプライヤーに確認は必要ありません）と十分に前処理であることを確認してください。その後PBS 3Xでよく洗う 2。膜が乾燥しないように 3。あなたが井戸に出てピペッティングの前に良い相同な細胞懸濁物を持つように穏やかに細胞を混ぜていることを確認 |
| ブランクセンター | 1。洗濯による被害 | 1。自動洗濯機（またはピペッティング）で流量が高すぎる可能性があります。もっと穏やかに洗浄の手順を必要とする |
| 偽陽性 | 1。二次抗体の凝集体 2。まだ膜上で細胞 3。細胞培養の汚染 | 1。二次抗体をフィルタリング 2。すべての細胞は二次抗体のインキュベーションの前にPBS Tween 20を有する膜から洗浄されていることを確認します。メンブレン上に残って細胞は不規則な形の斑点を与える 3。可能な限り無菌でクリーンな試薬を保管してください。あなたの細胞培養技術は無菌であることを確認してください。メディアのネガティブコントロールを実行することにより、偽陽性を確認してください。プレート運動のために、 不完全に定義されたスポットを参照してください。 |
| コンフルエントスポット | 1。貧しいコーティング、あまりにも多くの抗体 2。長期細胞培養 3。細胞が過剰刺激 | 1。一次抗体の濃度を減少させる 2。長い細胞がインキュベートされ、より多くのサイトカイン/タンパク質、それらが分泌されます。これは、マージと区別がつかないになるために開始される大規模なスポットになります。 3。細胞培養工程のインキュベーション時間を減らす。過剰刺激は、細胞によって分泌されるサイトカイン/タンパク質の多くになります。これは、マージと区別がつかないになるために開始されるスポットを生成します。短い時間のための培地または培養で刺激の量を減らす |
| 不完全定義されたスポット | 1。膜ではない前処理は、（あなたの膜がこれを必要とする場合、供給者に確認してください） 2。細胞のインキュベーション中に、プレートの動き | 1。膜をエタノールで前処理する必要がありますかこれはファジー、不十分な定義のスポットになる可能性があります。読者はこれらを区別することは難しいだろう 2。プレートは複数のスポットを作成するに移動している細胞と細胞のインキュベーション中に移動させないようにしてください。可能であれば、インキュベーション中には開かれません、専用のインキュベーターを使用してください。セルを追加した後にプレートをタップしないでください。 |
| ポジティブコントロールのウェルは低いです。 | 1。低開発は - ストレプトアビジン- ALPおよび/または室温に移されていないBCIP / NBTソリューションを使用しての結果である可能性があります | 1。ウェルに追加する前に室温に試薬をもたらす |
| スポットの密度は、それが困難なそれらを定量化することができます | 1。あまりにも多くの細胞がウェルに添加した | 1。明確なスポットの形成につながる細胞の最適な数を決定するために、細胞の希釈（すなわち、1 × 10 6、5 × 10 5、1 × 10 5、5 × 10 4、1ウェルあたり× 10 4細胞）を作る |
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Discussion
ELISPOTアッセイは、ヒトおよび他の種の様々な免疫応答を監視するために最も重要で広く使用されているアッセイの一つとして浮上している。 ELISPOTアッセイにより、免疫細胞の頻度は、細胞集団の拡大または操作することなく、単一細胞レベルで測定することができます。 ELISPOTアッセイは広く感染症、がん、アレルギー、自己免疫疾患を含む種々の疾患で抗原特異的免疫応答を調査するために適用されています。このアッセイのアプリケーションは、主に抗原特異的細胞の定量が重要かなどの抗生物質療法1の前または後に結核などの様々な疾患の状態、内の特定の抗原に対する免疫応答の比較である研究に応用されている。しかし、最近の報告では、このアッセイはそのような腹水、脳脊髄液または気管支肺胞洗浄液などの絶縁された細胞物質内で抗原特異的T細胞の頻度を検出するために使用されることが示されている。ソンハンキムら。アル。腹部結核が疑われる患者由来のPBMCをELISPOTアッセイを使用して、アクティブな腹部結核2を診断するための89％の感度があることが示されている。また、T細胞ベースのELISPOTアッセイは、末梢血と髄液単核細胞3を使用して結核により、中枢神経系の関与が疑われる患者では活動性結核の診断で91％の感度を持っている。示されている当研究室では、サルコイドーシスの患者からPBMCにおけるマイコバクテリア抗原ESAT - 6の細胞認識を評価するためのELISPOTアッセイを利用しています。それは、ELISPOTアッセイが4,5特発性疾患の感染性病原体の役割を記述するための診断方法としても使用する方法を示しているため、このレポートは重要です。このアッセイのもう一つの利点は、それはまた、BCG接種を受けた患者における結核の同定を可能にするです。アッセイは、このようなステロイドの使用とHIV感染6のような免疫抑制条件によって限定されるものではない。また、ヒト免疫不全ウイルスの定量化と特性評価（HIV）特異的CD8 + T細胞応答7を容易にした。応答は、さらにそのようなアスペルギルスフミ 8などの微生物抗原、に健常者の間で検出することができます。 ELISPOTは、ハンタウイルス心肺症候群9の生存者から免疫抗原を同定するために使用されているだけでなく、慢性のHIV感染10の間にT細胞機能を評価する。のためのin vitro培養における短期から、測定された応答が密接にin vivoでのT細胞の頻度に反映しています。 ELISPOTアッセイは、このようなリンパ球増殖アッセイ（LPA）と細胞傷害性Tリンパ球（CTL）アッセイとして"標準"T細胞アッセイの中で最も低い検出のしきい値を持っています。この要約は、比較的簡単、安価なアッセイの広大な可能性の限られたビューを提供します。このアッセイの可能なアプリケーションが拡大し続ける。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
研究資源、国立衛生研究所のナショナルセンターからバンダービルトCTSA助成金1 UL1 RR024975によって部分的にサポート。この作品は、NIHのR01 HL 83839によって賄われていた。R01 AI 65744。
Materials
A. Preparation of Media |
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B. Preparation of Tris Buffer |
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C. Materials necessary for ELISPOT analysis: |
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References
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