Summary
可以通过使用的酶联免疫检测鉴定的微生物指标在特发性疾病的适应性免疫。
Abstract
适应性免疫是清除细胞内病原体的一个重要组成部分。检测和量化这些反应在人类的能力是一个重要的诊断工具。酶联免疫斑点法（ELISPOT）获得其对微生物的抗原，包括人群，如那些与艾滋病毒感染，移植免疫抑制，并使用类固醇的细胞免疫反应的能力，以确定的普及。此实验的能力量化针对特定微生物抗原的免疫反应，以及区分这些对策Th1或Th2型性格。酶联免疫斑点法不限于炎症部位。它是多才多艺的，在其评估的外周血，以及支气管肺泡灌洗，脑脊髓液，腹水，如积极参与网站内的免疫反应的能力。对一个或多个抗原免疫反应的检测是可能的，以及微生物蛋白质内的特定抗原决定簇。此实验有利于检测的免疫反应，随着时间的推移，以及在宿主T细胞识别抗原的区别。双色酶联免疫斑点法检测可用于检测两种细胞因子的同时的表达。该技术的最新应用，包括诊断为肺外结核，以及调查传染病抗原的自身免疫性疾病的贡献。
Protocol
对于下面的协议，我们用外周血单个核细胞（PBMC）的细胞的利息。然而，该协议可用于其他类型的细胞。使用无菌技术在组织培养罩进行检测。
第1天：板和细胞的制备
- 取出ELISPOT板，并在引擎盖打开它。
- 150μL，使用多通道移液器的1X PBS洗板3次，如果有的话，是可以接受的，否则单以及吹打。
- 拿出一包水库，打开引擎盖。
- 新增2微克/毫升的捕获抗体，抗人干扰素-γ的，到11的1X PBS MLS。涡很好。将抗体混合水库。
- 放置到每孔使用多声道100μL的涂层解决方案。
- 包装封口膜板。
- 板放置在冰箱过夜。该板是好几个星期。经验法则是，如果仍然在井液左，板可以用。
细胞制备
如果是新鲜的外周血细胞计数和孵育过夜在37℃，5％的CO 2彗星。外周血单个核细胞储存在液氮，解冻的细胞是必要的。协议如下：
- 在37℃水浴，直到几乎完全解冻解冻细胞的离心管。
- 立即悬浮在5毫升R10的媒体。
- 5分钟旋转225 × G.
- 再次重悬在5毫升R10的媒体，并使用台盼蓝活细胞计数。
- 将浓度2 × 10 6细胞/毫升R10的媒体。
- 休息37通宵℃，5％的CO 2。
第2天：设立的板块
- 板盖标本识别号码，以及条件和日期的标签。
- 无菌1X PBS 150μL转储和blot方法，洗板6次。小心不飞溅板，同时倾销。这可能会导致板井变成紫色。
- 每孔加入100μLR20的。
- 孵育板在37 ° C为1小时。
- 虽然该板块孵化，计数细胞休息过夜。
- 5分钟1500转的旋转细胞悬液。弃上清，悬浮颗粒，让您有一个终浓度为1X10 6每1ml细胞在R10媒体。
- 1小时的潜伏期后，取出R20的使用dump和blot方法。小心不飞溅板，同时倾销。
- 加入100μL细胞液（10 5个细胞），以每口井。添加适当的肽类和/或抗原重复相应的井。使用新的枪头，每次你进入肽的工作方案。正常肽浓度为10-40微克/毫升。由于肽的不同，每个研究者应滴定肽，以获得最佳的效果。
- 在阴性对照井，只有细胞（不肽添加）
- 在阳性对照井，添加植物血凝素（PHA 10微克/毫升; Sigma公司）。
- 在37℃过夜，5％的CO 2（〜18小时） 。
第3天：开发板
- 洗板6次，150μL，1xPBS使用dump和印迹法。
- 添加100μL，PBS以及每板使用多通道移液器。
- 板放入冰箱15分钟。
- 取出冰箱板，并放置在组织培养罩。
- 准备生物素抗体解决方案
- 0.5微克/毫升的生物素抗体（MAB 7 - B6 - 1）加入11mL PBS。
- 涡的解决方案，拌匀。
- 如果规划添加使用多通道的解决方案，倒入水库。
- 由弹进废纸篓，丢弃的PBS。要小心不飞溅板，同时倾销。
- 将每孔100μL的解决方案。
- 孵育一小时，在室温下的组织培养罩板。
- 150μL1xPBS使用转储和blot方法清洗板的6倍。在第 6 次清洗，离开板的PBS，直到你有准备的链霉亲和抗体。
- 准备的链霉亲和抗体。
- 添加5.5μ升链霉亲和抗体（链霉亲和ALP）11mL PBS（1:2000稀释）。
- 涡的解决方案，拌匀。
- 如果规划添加使用多通道的解决方案，倒入水库。
- 留在井的倒掉PBS和杂交板。
- 加入100μL链霉亲和解决方案，以每口井。
- 孵育1小时在室温下的组织培养罩板。
- 洗净板用PBS使用dump和杂交方法的6倍。在6 日洗，离开盘上的PBS，直到你有颜色的解决方案。
- 在黑暗中工作。准备碱性磷酸酶底物溶液（碱性磷酸酶底物试剂盒四BCIP / NBT）：
- 添加4滴基板试剂1至11 mL的Tris缓冲液，涡旋以及。 Tris缓冲液，涡旋以及添加4滴试剂2基板。 4底物试剂3滴添加Tris缓冲液，涡旋以及。
- 倒掉剩余的PBS和杂交板。
- 加入100μL的色彩解决方案以及每板使用多声道。
- 打开灯光后5至10分钟的彩色发展。
- 允许色剂，以保持板，直到点开始变成紫色，很暗。这要花费5至20分钟。要小心不要离开太久基板的解决方案，因为这样做可能会引起高背景。
- 用自来水清洗ELISPOT板的3倍。
- 保持干燥约一个小时或隔夜。
- 手动或酶联免疫斑点法酶标仪读板。
- 商店板远离光线照射在一个盒子里。
代表性的成果：
酶联免疫斑点法的目的是对微生物抗原定量免疫反应。每个点表示一个单一的响应细胞，表达细胞因子的利益。这些点可以算作手动或使用酶联免疫斑点法酶标仪。
评估，酶联免疫斑点法已被正确地执行，应首先调查背景感兴趣的细胞因子的生产阴性对照。阴性对照井人会希望看到无斑点，虽然可能会出现一个小的背景（紫色）。通常情况下，应小于平均每口井五点。阳性对照井确认已执行的反应正确，细胞抗原刺激的反应。阳性对照井，你希望看到深紫色的背景下，由于一个点（图1）合流。应该有一点没有白色背景。如果阳性对照，阴性对照样品是合适的，可以再算上含有抗原利益的井。一个“不理想”的结果将反映高背景（井紫色），无斑点或极少数斑点，空白中心，定义不清的斑点或汇合点。提供故障排除提示列表（见表1）。
图1。ELISPOT板的代表。每个板块应包含阳性对照，阴性对照和肽在两口井最低进行的利益。 C9，C10，D9，D10的阳性对照井，你可以看到有深紫色的颜色，融合细胞和几乎没有任何白色背景。阴性对照井G11，G12，H11和H12。这些水井都没有如预期般的紫色背景和无斑点。点七国集团，八国集团，H7和H8，说明微生物肽的细胞反应;紫色斑点代表一个单一的反应细胞表达细胞因子的利益。
表1
| 观察 | 可能出现的问题 | 可能的解决方案 |
| 高背景 | 1。膜两侧冲不正确 2。过多的脑细胞分泌细胞因子 3。板不妥善干 4。在开发板 | 1。之前和之后的颜色发展双方的膜用蒸馏水洗净。试剂通过细胞膜进入基地的板块可能会泄漏，如果没有冲走，这些可能会导致高背景。 2。每孔细胞数量减少，这将需要优化 3。干板前阅读 4。减少开发时间 |
| 无斑点/很少有斑点 | 1。没有足够的细胞分泌细胞因子/蛋白 2。确保正确的细胞受到刺激 3。不为l细胞王景荣不够或可能需要一段时间，到兴奋剂的反应 4。发展不足的颜色 5。没有足够的小学或中学的抗体 | 1。增加细胞的数量。这将需要优化 2。还可以使用积极的刺激控制 - 一种兴奋剂，你知道会诱发细胞因子/蛋白表达 3。增加细胞孵育时间或使用间接法（预先处理的细胞与兴奋剂） 4。监测架空镜下颜色的发展，并确保发展中国家试剂已正确储存，并没有失去活性 5。将需要增加小学和/或继发性抗体浓度。这将需要优化。 |
| 空白区 | 1。膜没有预先处理 2。膜已经干涸了，在一些阶段 3。细胞分布不均 | 1。确保膜有足够的预处理用70％乙醇（所有膜不需要这样检查与您的供应商）。用PBS 3X洗好之后 2。确保膜不会干 3。确保你混合细胞轻轻吹打入井前有一个良好的同源细胞悬液 |
| 空白中心 | 1。从洗衣机损坏 | 1。自动洗板机（或移液）流率可能过高。需要一个更柔和的洗涤程序 |
| 误报 | 1。二级抗体聚合 2。细胞膜上的细胞仍 3。细胞培养污染 | 1。过滤器的二次抗体 2。确保所有的细胞用PBS吐温20的二抗孵育前膜洗净。左膜细胞会给不规则形斑点 3。保持试剂，消毒和尽可能干净。确保您的细胞培养技术是无菌的。通过运行媒体阴性对照检查误报。板块运动， 定义不清的点 |
| 聚合景点 | 1。标准普尔涂料，过多的抗体 2。长时间细胞培养 3。细胞过度刺激 | 1。减少的主要抗体浓度 2。时间越长，细胞培养，细胞因子/蛋白，他们将分泌。这将导致更大的点，将开始合并，成为难以区别。 3。降低细胞培养步骤孵化时间。过度刺激会造成大量的细胞分泌的细胞因子/蛋白质。这会产生斑点，将启动合并，成为难以区分。在文化传媒或文化兴奋剂金额减少较短的时间 |
| 不好定义的景点 | 1。膜不预先处理（如果你的膜需要，请与供应商） 2。细胞孵化期间的板块运动 | 1。膜必须进行预处理与乙醇或这可能会导致模糊，定义不清的斑点。这将是为读者很难区分这些 2。不要让盘在细胞孵化提出的细胞会创建一个点以上。如果可能的话使用一个专门的孵化器，将不会在潜伏期打开。不要挖掘后，加入细胞板 |
| 阳性对照孔低 | 1。不发达 - 可能是一个尚未带来室温使用链霉亲和ALP和/或BCIP / NBT解决方案的结果 | 1。增加井前将试剂置于室温 |
| 点的密度，使得它难以量化 | 1。过多的脑细胞被添加到井 | 1。对细胞的稀释（即1 × 10 6，5 × 10 5，1 × 10 5，5 × 10 4，1 × 10 4细胞，每孔），以确定最佳的细胞数量，这将导致形成踩点 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
酶联免疫斑点法检测已成为最重要和最广泛使用的检测，监测人体的免疫反应和各种其他物种。酶联免疫斑点法检测，免疫细胞的频率可以测量在单细胞水平上没有膨胀或操纵细胞群。酶联免疫斑点法检测已被广泛应用于各种疾病，包括感染，癌症，过敏症和自身免疫性疾病的抗原特异性免疫反应调查。这个实验中的应用已基本适用于量化是非常重要的抗原特异性细胞或特异性抗原的免疫反应，在各种疾病状态，如结核病的抗生素治疗1之前或之后，比较研究。然而，最近的报告表明，此法可用于检测在孤立的细胞物质，如腹水，脑脊髓液中或支气管肺泡灌洗中的抗原特异性T细胞的频率。宋汉金等。等。怀疑腹腔结核患者外周血单个核细胞酶联免疫斑点法检测表明，有一个活跃腹腔结核2诊断的灵敏度为89％ 。它也已表明，基于T细胞酶联免疫斑点法检测中枢神经系统受累的怀疑使用外周血和脑脊液中单核细胞 3的结核患者中91％为活动性结核病的诊断敏感性。我们的实验室采用酶联免疫斑点法检测评估结节病患者PBMC中分枝杆菌抗原ESAT - 6的细胞识别。这份报告是重要的，因为它显示了如何ELISPOT检测可作为诊断的方法来界定 4,5特发性疾病，传染性病原体的作用也。这个实验的另一个好处是，它也可以让结核病的患者曾接受卡介苗接种的鉴定。检测是不是如使用类固醇和感染艾滋病毒的6的免疫条件的限制。它也促进了定量分析和表征的人类免疫缺陷病毒（HIV）的特异性CD8 + T细胞反应。在正常人微生物的抗原， 如 曲霉 8中，反应甚至可以被检测到。酶联免疫斑点法也被用来确定汉坦病毒心肺综合征9，以及评估在慢性感染艾滋病毒的10的T细胞功能的幸存者的免疫显性抗原。由于短期体外培养，测得的响应，密切反映在体内的T细胞的频率。酶联免疫斑点法检测“标准的”T细胞，如淋巴细胞增殖实验（LPA）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）检测实验中的最低检测阈值。这总结只提供了有限的观点相对简单，价格低廉的检测的巨大可能性。这个实验中可能的应用领域不断拓展。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
范德比尔特CTSA的成员授予1 UL1 RR024975的一部分，由国家研究资源，国立卫生研究院中心的支持。这项工作是由美国国立卫生研究院R01 HL 83839; R01人工智能65744。
Materials
A. Preparation of Media |
|||
 |
|||
B. Preparation of Tris Buffer |
|||
|
|||
C. Materials necessary for ELISPOT analysis: |
|||
 |
References
- Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis. Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).
- Sung, H. K. E. Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells. Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).
- Kim, S. -H. Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells. Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).
- Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis. Infect Immun. 75, 527-530 (2007).
- Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses. Respir Res. 25, 36-36 (2008).
- Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden. Thorax. 65, 315-320 (2010).
- Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research. Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).
- Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens. PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).
- Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus. PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).
- Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., Côté, P., Baril, J. G., Thomas, R., Vézina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., Sékaly, R. P., Bernard, N. F. Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection. Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).
