Synnerven transection: En modell av Vuxen Neuron apoptos i det centrala nervsystemet

Summary

Synnerven transection är en allmänt använd modell av vuxna CNS-skada. Nittio procent av retinal ganglion celler (RGC: er), vars axoner är helt transected (axotomy) dör inom 14 dagar efter axotomy. Denna modell är lätta att experimentella manipulationer och mycket reproducerbar.

Abstract

Retinal ganglion celler (RGC: er) är CNS-nervceller som utdata visuell information från näthinnan till hjärnan via synnerven. Synnerven kan nås inom bana i ögat och helt transected (axotomized), skära av axoner av hela RGC befolkningen. Synnerven transection är en reproducerbar modell av apoptotiska nervcellsdöd i vuxna CNS ^1-4. Denna modell är särskilt attraktiva eftersom glaskroppen kammare i ögat fungerar som en kapsel för drug delivery till näthinnan, som möjliggör experimentella manipulationer via intraokulära injektioner. Spridning av kemikalier genom glaskroppen vätska ser till att de agerar på hela RGC befolkningen. Dessutom kan RGC: er vara selektivt transfekterade genom att korta interfererande RNA (siRNA), plasmider eller virala vektorer på den avskurna ändan av synnerven ^5-7 eller injicera vektorer i deras mål, den överlägsna colliculi ^8. Detta gör det möjligt för forskare att studera apoptotiska mekanismer i önskad neuronala befolkningen utan störande effekter på andra åskådare nervceller eller omgivande Glia. En ytterligare fördel är den lätthet och precision med vilken cellöverlevnad kan kvantifieras efter skada. Näthinnan är en platt, lager vävnad och RGC: er är lokaliserade i de innersta lager, ganglion cellager. Överlevnad RGC: er kan spåras över tid genom att tillämpa en fluorescerande spårämne (3% Fluorogold) på den avskurna ändan av synnerven vid axotomy, eller genom att injicera spårgas i den överlägsna colliculi (RGC mål) en vecka före axotomy. Den spårämne är retrogradely transporteras, märkning hela RGC befolkningen. Eftersom gangliecell lagret är ett monolager (en cell tjock), kan RGC densiteter kvantifieras i platta monterad vävnad, utan behov av stereology. Synnerven transection leder till apoptotisk död 90% av skadade RGC: er inom 14 dagar postaxotomy ^9-11. RGC apoptos har en karakteristisk tid-kurs där celldöd är försenad 3-4 dagar postaxotomy, varefter cellerna snabbt urarta. Detta ger ett tidsfönster för experimentella manipulationer som riktas mot involverade i apoptos.

Protocol

1. Kirurgisk teknik

1. Experiment bör utföras med aseptisk teknik och efter protokollen djuret använda dina specifika institutionen. Instrument och material (lösningar, testa ämnen, spårämnen, nålar, etc.) kommer i kontakt med levande vävnad måste vara steril för att förhindra infektion och negativa effekter på djurens välbefinnande och potentiella negativa effekter på studien.

2. Anestesi

1. Råttor blir nedsövd med hjälp av en veterinär isofluran Vaporizer system. Använd medicinsk kvalitet syre med en hastighet av 0,8 l / min för att förånga isofluran gas. Placera djuret i den bifogade anestesi rutan och ring in en isofluran koncentration 4% tills andning har mattats och djuret är stillsam.
2. Därefter växlar gasflöde till gasmask fäste för stereotaxic ramen och placera djuret i stereotaxic apparaten. Vrid isofluran koncentrationen skall sjunka till 2% och övervaka narkos. Större djur (> 300g) kan kräva en högre koncentration av isofluran. Anestesi bör övervakas under operation och isofluran dosen justeras därefter. Djup och graden av andning bör ständigt utvärderas och tå nypa utvärdering (var 5 min) för avsaknaden av djup smärta ska utföras.
3. När operationen är klar, stäng av isofluran och låt djuret att andas syre i flera minuter innan de tas bort från stereotaxic enhet. Kroppstemperaturen bör bibehållas genom att täcka djuret med en kirurgisk filt och / eller med hjälp av en reglerad värme filt under operation.

3. Kirurgisk metod

1. Blöt pälsen på toppen av huvudet med 70% etanol för att göra pälsen lättare att skära. Ta bort päls från mellan ögonen med en klippare eller vass sax. Rengör snittet området tre gånger med omväxlande program av jod rengöringsmedel (Proviodine, Betadine, etc) följt av 70% etanol. Behåll hornhinnan fuktig hela operationen genom att tillämpa salva oftalmologiska ögat (Tears Naturale PM) på hornhinnan. Sprid salvan över ytan av hornhinnan genom att manuellt öppna och stänga ögonlocken.
2. Med hjälp av en nr 11 blad, gör ett snitt längs mittlinjen på huvudet från ca 0,5 cm framför ögonen till 1 cm bakom ögonen. Dra fliken på huden över ögat med hjälp av pincett och försiktigt reta bort den underliggande bindväv med baksidan av skalpell. Sedan tillbaka locket av hud sidled och nedåt och håll på plats med en kirurgisk upprullningsdon som kan tejpas på basen av stereotaxic instrumentet.
3. Gör ett snitt längs med överlägsna kanten av omloppsbanor benet och samtidigt dra i den överliggande fascia med vassa pincett. Detta kommer att återkalla fascian överliggande omloppsbana ögat. Kanten av orbital ben kan tydligt avgränsade genom att använda pincett för att trycka ner på fascian överliggande i omloppsbana. Med hjälp av en diatermi enhet eller skalpell, fortsätter snittet bakåt mot den bakre gränsen för bana i ögat. Använd benet av den överlägsna bana som en guide för snittet. Nästa fortsätta snittet framåt mot den främre gränsen för bana. Snittet för de överlägsna omloppsbana görs bäst med en liten kauterisation anordning för att förhindra blödning från underliggande kärl som kommunicerar med venösa bihålor.
4. Om blödning uppstår flera åtgärder kan vidtas. För det första utöva tryck med hjälp av sterila kirurgiska kompresser eller kompresser bomull. Om blödningen fortsätter, gäller kall, steril koksaltlösning fosfatbuffert (PBS) till området med hjälp av en dropper, och bibehålla trycket. Mindre blödning stannar efter några sekunder med hjälp av denna procedur. Om blödningen kvarstår gäller dragkraft till vävnaden med kirurgiska kompress eller bomullstuss för att identifiera orsaken till blödningen och snabbt bränna äventyras fartyget. När blödningen finns, använda kallt sterila PBS för att rengöra den kirurgiska området av blod. Den kirurgiska området bör regelbundet rengöras på detta sätt för att bättre kunna visualisera strukturer i omloppsbana i ögat.
5. När snittet har rengjorts, använd pincett och baksidan av skalpell för att rengöra bindväven längst bak i ögat som overlies den kretsande innehåll. På baksidan av nr 11 skalpell fungerar bra som spetsen är bra. Detta kommer att öppna upp djupare delar av omloppsbanor hålrum som ger ett större kirurgiskt fönster att arbeta i. Använd Dumont # 7b vassa böjda-räfflad tång när du arbetar i ögat som deras krökning och fina tips är idealiska för att manipulera strukturer i omloppsbana. Dessutom tandningen hjälp med gripande strukturer.
6. Ta sedan bort den bindväv som omger oftalmologiska uppdelningen av trigeminusnerven som sitter nära mittlinjen och ta bort nerven med hjälp av pincetten. Detta steg är dock inte nödvändigt att ta bort nerven kommer att ge ett större fönster med tillbehörs på synnerven senare.
7. Efter avlägsnande av nerv Använd pincett för att dra blodkärl nedan och helt bränna fartyget. Detta steg är inte heller nödvändigt, kan dock kauterisation av fartyget att den kan flyttas anteriorly och därigenom skapa ett större fönster när synnerven nås.
8. Använd en vass pincett eller tång som har fått sina tips böjt inåt för att försiktigt plocka och ta bort det tunna lagret av bindväv över extraocular muskler och lacrimal körtel. Dra in den extra okulära musklerna från främre till bakre delen av banan. Grip den proximala delen av muskeln med en pincett och använda ett andra par böjda räfflad tång ögat dressing att tillämpa utåt dragkraft på muskeln. Se till att ögat förbandet pincetten är orienterade i samma riktning som muskeln när man drar för att undvika att riva. Ta bort det mest anterior muskeln i omloppsbana (Superior Oblique) på detta sätt. Muskeln kommer att bli befriat från djupt inne i omloppsbana och den återstående längden kan dras för att rotera ögat utåt.
9. Upprepa steg 3,8 med nästa muskeln (Medial Rectus) som ligger mellan lober lacrimal körteln och Harderian Gland nära mittlinjen på dorsala ytan av ögat. Tejpa ner upprullningsdonet att bibehålla dragkraft på musklerna.
10. Ta försiktigt bort eventuella kvarvarande bindväv över ytan av lacrimal körtel och lyft körteln uppåt med hjälp av pincett. Inte komprimera eller pressa körteln. För att dra tillbaka körtel, behöver bara ett enda fartyg vid den bakre stolpen som ska flamberats. Lyft den bakre änden av körteln uppåt, och sedan bränna fartyget.
11. Nästa flik på lacrimal körteln fram emot att öppna den bakre delen av banan och ge obehindrad tillgång till de muskler som overlie synnerven. Håll området ständigt fuktiga med hjälp av sterila PBS och torka med kirurgisk kompresser eller kompresser bomull.
12. Med vassa pincett återigen ta bort den tunna bindväv som omger musklerna i bakre bana (levator palpebraesuperior och Superior Rectus) och separera den underliggande knippen av muskler. Dra musklerna självständigt eller unisont, med hjälp av böjda räfflade pincett ögat dressing, återigen, att dra i linje med muskelfibrerna. Fäst resterande muskler längder upprullningsdonet tillsammans med de muskler som var indragna i steg 3,8 och 3,9 och tejpa ner upprullningsdonet att tillämpa dragkraft. Totalt 4 muskler kommer nu att bifogas upprullningsdonet. Detta kommer att rotera ögat framåt och utåt för att avslöja det fett som innehåller slida som omger synnerven.

4. Åtkomst synnerven

1. Använd vass pincett (Fin spets Dumont) att dra uppåt på bindväv som omger fet mantel av synnerven. Gör ett längsgående snitt med små Vannas våren sax. Expandera skär som behövs. Det fett som skidan börjar bukta ut när snittet görs. Nästa bort flikarna av bindväv genom att försiktigt dra uppåt från kanten och skära av den halvmåneformade flikar av vävnad.
2. Ta bort fettet överliggande synnerven genom att använda pincett för att dra i fett, och samtidigt minska med Vannas våren sax. Håll området rent med hjälp av sterila PBS och kirurgiska svabbar för att rengöra små mängder blod som uppstår vid avlägsnande av vävnad.
3. Synnerven är nu synlig. För att få tillgång nerven måste meningeal slida som omger nerven tas bort utan att skada oftalmologiska artär som förser den inre näthinnan. Undersök det vaskulära mönstret av meningeal slida med pincett för att försiktigt rotera slida. Titta efter ett område saknar blodkärl, och tillåter ett längsgående snitt göras i meningeal slida.
4. Använda fin spets Dumont pincett, klämma dura och dra uppåt. Nära botten av triangelformade kilen dura som skapas med hjälp av Vannas våren sax för att göra ett litet snitt i slidan. Sätt i nedre bladet på saxen i snittet och skär slida parallellt med riktningen på synnerven, noga med att inte skada kärlsystemet med laterala snitt. Använd pincett och sax för att drapera den dura till endera sidan av synnerven.
5. Den enda återstående täckning av nerven spindelvävshinnan membranet. Det är mycket tunn och genomskinlig. För att avgöra om membranet är fortfarande närvarande, vassa pincett nypa ytan av nerv. Det spindelvävshinnan är närvarande, nypa membranet och dra uppåt för att skapa en triangulär kil av vävnad. Gör ett litet snitt med spetsen på saxen som steg 4,4. Sedan sätter den nedre bladet på saxen och gör ett längsgående snitt i spindelvävshinnan. Nästa, använd din sax och pincett för att drapera spindelvävshinnan till endera sidan av synnerven.
6. Med hjälp av en mikro-surgiska krok, lyfta upp synnerven ut ur meningeal slida. Passera av kroken runt den yttre kanten av nerv och se till att kroken håller kontakt med nerven, så att du inte fånga meningeal membran med kroken och misstag transekt dem. Lyft försiktigt synnerven ut ur meningeal slida och helt transekt nerven bakom den punkt som stöds av kroken. Den transected synnerven stubbe kommer nu att ha en fri ände, vilket möjliggör avlägsnande av kroken.
7. Om RGC: er kommer att retrogradely märkta så att kvantifiera överlevnad, placera en liten bit av gelfoam indränkt i 3% Fluorogold (eller annat bakåtsträvande spårämne) över transected synnerven stubbe (se JUPITER-protokoll 2261 ).

5. Utgående och återställning

1. Avlasta dragkraften på den extra okulära musklerna och återgå ögat till en neutral position. Medan du gör det, se till att driva gelfoam ner i omloppsbana i ögat att så ögat vrids på plats, förblir gelfoam runt synnerven stubben. Returnera lacrimal körtel och extra muskler okulär till deras naturliga positioner.
2. Återgå fliken av hud med mittlinjen och sutur såret. Applicera salva oftalmologiska öga i båda ögonen. Sedan stänga av isofluran och tillåter djuret att andas syre i flera minuter. Placera djuret i en uppvärmd bur eller en bur under en värmelampa att återhämta sig. Placera inga sängkläder på återhämtning buren för att eliminera risken för aspirerande sängar under återhämtning.
3. Djur bör hållas självständigt efter operationen. Inlägg kirurgiska analgetika ska ges i enlighet med riktlinjerna i din djurvård myndigheter och djur bör övervakas noggrant efter operationen.

6. Representativa resultat:

Transection av synnerven leder till förlust av 90% av skadade RGC: er inom 14 dagar postaxotomy ^9-11. Den viktigaste mekanismen RGC döden är apoptos ^{9, 12.} Den normala tätheten av RGC: er är ca 2500 celler / mm ^2. Epifluorescence eller konfokal avbildning kan användas för att visualisera retrogradely märkt RGC: er efter axotomy. RGC apoptos är fördröjd med cirka 4 dagar efter axotomy och lämnar ett tidsfönster för experimentell manipulationer. På en dag efter axotomy och bakåtsträvande märkning med Fluorogold, RGC cell organ i gangliecell lagret av näthinnan och fascicles axonet i nerven fiberskikt av näthinnan är tydligt synliga när imaging en flatmounted beredning (Fig. 1a). Genom 14 dagar efter axotomy, har majoriteten av RGC: er dog, och några kvarvarande RGC: er varvas mellan näthinnans mikroglia (Figur 1b). När RGC: er genomgår apoptos, mikroglia phagocytose döda celler och som en följd blir transcellularly märkta med fluorescerande spårämne som användes för att märka RGC: er ^{13, 14.} Utseendet på spårämne i phagosomes av mikroglia skiljer sig från att överleva RGC: er. Mikroglia innehålla spårämne i mycket koncentrerad och väldigt ljusa phagosomes som är relativt stora och spridda över hela deras cytoplasma (fig 1c). RGC: er har en mer diffus mönster av färgning (fig 1c) med små punktuell blåsor som har retrogradely transporteras ner sina axoner arkivering cellens cytoplasma. Dessa blåsor är mycket mindre och har mindre intensiv fluorescens tillåter en att skilja överlevande RGC: er från mikroglia. Dessutom mikroglia har mycket mindre cell organ och tenderar att ha en stellate eller amöboid morfologi i motsats till RGC: er som har relativt stora och rundade cell organ. Den dendritiska träd RGC: er kan också hjälpa skilja dem från den korta ljusa processer av mikroglia, när kvantifiera cellöverlevnad. Cellöverlevnad kan kvantifieras i olika delar av näthinnan och densitet (celler / mm ²⁾ kan extrapoleras från området för motsvarande micrographs eftersom RGC: er finns i en monolager inom ganglion cellager.

Figur 1. Epifluorescence micrographs av Fluorogold märkt RGC: er efter axotomy och tillämpning av spårämne på synnerven stubben. (A) 1 dag efter axotomy RGC: er och deras fascicles axonet är märkta med spårämne i en fin punktuell sätt. (B) med 14 dagar efter axotomy, har 90% av RGC: er dog och ljust märkt mikroglia som har fagocyteras döda celler även är märkta med spårämnen. (C) högre förstoring illustrerar skillnaden mellan RGC: er och mikroglia (röda pilspetsar) på 14 dagar postaxotomy. Skala bar i A och B med 50 mm. Skala bar i C är 25 ìm.

Discussion

Det finns många varianter av detta kirurgiska ingrepp och flera av de steg i detta protokoll inte är nödvändiga. Det är endast nödvändigt att dra tillbaka de muskler som overlie synnerven för att få tillgång till den nerven. Men detta resulterar i ett mycket begränsat arbetsutrymme runt nerven som gör det kritiska slutskedet av transection svårare. I vissa situationer är det önskvärt att transfektera cellerna från synnerven stubben och den ökade tillgången utrymme som ges genom dra tillbaka alla extraocular muskler och lacrimal körteln är fördelaktigt i detta fall.

Den mest kritiska stegen i protokollet steg 4,3-4,6. Det är viktigt att inte skada kärlen runt papillen. Den nerv bör transected 1,5-2,0 mm från bakre delen av ögat för att undvika skador på oftalmologiska artär som penetrerar nerven i en millimeter i ögat och matar blod till de inre näthinnan. Således kan genom att upprätthålla en liten arbetsgrupp avstånd från bakre delen av ögat skador på oftalmologiska artär undvikas. Näthinnan är normalt öppet och blodkärl kan vara tydligt avgränsade. Om näthinnan blodtillförsel skadas näthinnan kommer att urarta som leder till en mjölkvit flockig utseende. Glaskroppen kammare i ögat och linsen normalt moln över också, med ögat minskar i storlek över tiden.

Med lite övning kan alla steg i den fullständiga kirurgiska ingreppet ske i 10-15 minuter per öga, när den första posten nedskärningarna har gjorts. Förfarandet kan även ske från en lateral ansats till bana och antingen vägen är mycket mottaglig för formella ändringar baserat på preferenser av forskaren. Denna modell har en mycket reproducerbar tidsförloppet av celldöd och det finns flera sätt att rikta in sig på näthinnan globalt eller för att direkt rikta skadade RGC: er för att testa effekterna av experimentella behandlingar på cellöverlevnad.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.
Rat Gas Mask	Stoelting Co.
Anesthesia System	VetEquip	901806
Isoflurane (PrAErrane)	Baxter Internationl Inc.	DIN 02225875
Surgical Microscope	WPI, Zeiss, Leica
Fluorogold -(Hydroxystilbamidine bis(methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	39286
Gelfoam	Pharmacia Corporation (Pfizer)
Tears Naturale P.M.	Alcon
Proviodine	Medline Industries	MDS093945H
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-00
Fine tip Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-00
Micro surgical hook	Fine Science Tools	10062-12
Eye dressing serrated forceps	Fine Science Tools	11152-10
Dumont #7b sharp curved serrated forceps	Fine Science Tools	11270-20
Cauterizer	Fine Science Tools	18010-00