Summary
Optic Nerve doorsnijding is een veel gebruikt model van de volwassen CNS verwonding. Negentig procent van de retinale ganglioncellen (RGC), waarvan de axonen volledig doorsneden (axotomy) sterven binnen 14 dagen na axotomy. Dit model is lastig om experimentele manipulaties en zeer reproduceerbaar.
Abstract
Retinale ganglioncellen (RGC) zijn CNS neuronen die uitvoer visuele informatie van het netvlies naar de hersenen, via de oogzenuw. De oogzenuw kan worden benaderd binnen de baan van het oog en volledig doorsneden (axotomized), het snijden van de axonen van de gehele bevolking RGC. Oogzenuw doorsnijding is een reproduceerbaar model van apoptotische neuronale celdood in de volwassen CZS 1-4. Dit model is vooral aantrekkelijk omdat het glasvocht kamer van het oog werkt als een capsule voor drug delivery aan het netvlies, waardoor experimentele manipulaties via intra-oculaire injectie. De verspreiding van chemische stoffen door het glasvocht vloeistof zorgt ervoor dat ze reageren op de hele RGC bevolking. Bovendien kan RGC selectief worden getransfecteerd door het toepassen van korte interfererende RNA (siRNA's), plasmiden, of virale vectoren om het afgesneden uiteinde van de oogzenuw 5-7 of injecteren van vectoren in hun doel, de superieure colliculus 8. Dit stelt onderzoekers in staat om apoptotische mechanismen in de gewenste neuronale populatie bestuderen zonder verstorende effecten op andere omstander neuronen of de omliggende glia. Een bijkomend voordeel is het gemak en de nauwkeurigheid waarmee de overleving van de cel kan worden gekwantificeerd na letsel. Het netvlies is een vlak, gelaagd weefsel en RGC zijn gelokaliseerd in de binnenste laag, het ganglion cel laag. Het voortbestaan van RGC kan worden gevolgd na verloop van tijd door het toepassen van een fluorescerende tracer (3% Fluorogold) om het afgesneden uiteinde van de oogzenuw op het moment van axotomy, of door het injecteren van de tracer in de superieure colliculus (RGC doel) een week voorafgaand aan de axotomy. De tracer is retrogradely vervoerd, de etikettering de hele RGC bevolking. Omdat de ganglion cellaag is een monolaag (een cel dik), kan RGC dichtheden worden gekwantificeerd in flat gemonteerd weefsel, zonder de noodzaak voor stereology. Oogzenuw doorsnijding leidt tot de apoptotische dood van 90% van de gewonden RGC binnen 14 dagen postaxotomy 9-11. RGC apoptose heeft een karakteristieke tijd-cursus, waarbij celdood wordt vertraagd 3-4 dagen postaxotomy, waarna de cellen snel degenereren. Dit levert een tijdvenster voor experimentele manipulaties gericht tegen routes die betrokken zijn bij apoptose.
Protocol
1. Chirurgische techniek
- Experimenten moeten worden uitgevoerd met aseptische techniek en na het gebruik van dieren protocollen van uw specifieke instelling. Instrumenten en materialen (oplossingen te testen stoffen, tracers, naalden, etc.) in contact komen met levend weefsel moet steriel zijn voor infecties en negatieve effecten te voorkomen dat op het dierenwelzijn en de mogelijke negatieve effecten op de studie.
2. Anesthesie
- Ratten zullen worden verdoofd met behulp van een veterinair isofluraan vaporizer systeem. Gebruik maken van medische kwaliteit zuurstof met een snelheid van 0,8 L / min aan de isofluraan gas verdampen. Plaats het dier in de bijgevoegde anesthesie box en kies in een isofluraan concentratie van 4% tot de ademhaling is vertraagd en het dier is rustig.
- Vervolgens schakelt de gastoevoer naar de gasmasker bevestiging voor de stereotaxische frame en plaats het dier in de stereotaxische apparaat. Draai de isofluraan concentratie tot 2% en monitoren anesthesie. Grotere dieren (> 300 g) kunnen een hogere concentratie van isofluraan. Anesthesie moet gevolgd worden tijdens operatie en isofluraan de dosering aangepast. Diepte en de snelheid van de ademhaling moet voortdurend worden geëvalueerd, en teen knijpen evaluatie (om de 5 min) voor de afwezigheid van diepe pijn te worden uitgevoerd.
- Zodra de operatie is voltooid, schakelt u de isofluraan en laat het dier om te ademen zuurstof gedurende enkele minuten voor verwijdering uit de stereotaxische apparaat. De lichaamstemperatuur moet worden gehandhaafd door het bedekken van het dier met een chirurgische deken en / of met behulp van een regelbare verwarming deken tijdens de operatie.
3. Chirurgische aanpak
- Maak de vacht op de top van het hoofd met 70% ethanol om de vacht makkelijker te snijden. Verwijder het bont van tussen de ogen met behulp van een klipper of scherpe schaar. Reinig de incisie gebied drie keer met afwisselende programma's van jodium detergent oplossing (Proviodine, Betadine, etc), gevolgd door 70% ethanol. Handhaaf het hoornvlies vochtig gedurende de operatie door het toepassen van oogheelkundige oogzalf (Tears Naturale PM) aan het hoornvlies. Verdeel de zalf over het oppervlak van het hoornvlies door het handmatig openen en sluiten van de oogleden.
- Met behulp van een blad nr. 11, maakt een incisie langs de middellijn van het hoofd van ongeveer 0,5 cm in de voorkant van de ogen tot 1 cm achter de ogen. Trek de klep van de huid over het oog met behulp van pincet en voorzichtig te plagen weg het onderliggende bindweefsel met de achterkant van de scalpel. Vervolgens trekken de klep van de huid lateraal en naar beneden en houd deze op zijn plaats met een chirurgische oprolmechanisme dat kan worden geplakt is aan de basis van de stereotaxische instrument.
- Maak een incisie langs de superieure rand van de orbitale bot, terwijl trekken aan de overliggende fascia met scherpe tang. Dit zal zich terugtrekken van de fascia bovenliggende de baan van het oog. De rand van de orbitale bot kan duidelijk worden afgebakend door gebruik te maken tang naar beneden druk op de fascia overliggende de baan. Met behulp van een cauterisatie-apparaat of een scalpel, achteruit gaan met de incisie naar de achterkant grens van de baan van het oog. Gebruik het bot van de superieure baan als gids voor de incisie. Volgende blijven de incisie naar voren in de richting van de voorste grens van de baan. De incisie van de superieure baan kan het beste gebeuren met behulp van een kleine cauterisatie-apparaat om te bloeden te voorkomen dat de onderliggende vaten die communiceren met de veneuze sinussen.
- Als bloeden optreedt een aantal stappen kunnen worden genomen. In de eerste plaats toe te passen druk met behulp van steriele chirurgische swabs of wattenstaafjes. Als bloeden blijft van toepassing koude, steriele fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) om het gebied met behulp van een druppelaar, en onderhouden van de druk. Kleine bloeden stopt na enkele seconden met deze procedure. Als bloeden aanhoudt, gelden tractie aan het weefsel met de chirurgische wattenstaafje of wattenstaafje om de bron van bloeden te identificeren en snel cauterize de besmette schip. Nadat het bloeden is opgenomen, gebruik koud steriel PBS tot de chirurgische gebied van bloed schoon te maken. De chirurgische gebied moet regelmatig worden schoongemaakt op deze manier om beter structuren te visualiseren in de baan van het oog.
- Nadat de incisie is schoongemaakt, een tang en de achterkant van de scalpel om het bindweefsel schoon aan de achterkant van het oog dat de orbitale inhoud ligt over. De achterkant van de nummer 11 scalpel werkt goed als de tip is prima. Dit opent diepere delen van de orbitale holte voorzien in een grotere chirurgische venster om te werken inch Gebruik Dumont # 7b scherpe gebogen-gekarteld pincet bij het werken in het oog als hun kromming en fijne tips zijn ideaal voor het manipuleren van structuren in de baan. Bovendien is de vertanding te helpen met aangrijpende structuren.
- Verwijder vervolgens het bindweefsel dat de oogheelkundige afdeling van de nervus trigeminus, die zit de buurt van de middellijn omringt, en verwijder de zenuw met behulp van pincet. Deze stap is niet noodzakelijk, maar het verwijderen van de zenuw zorgt voor een groter venster van access aan de oogzenuw later.
- Na verwijdering van de zenuw, een tang om het bloedvat beneden trekken en volledig cauterize het schip. Deze stap is ook niet nodig, maar cauterisatie van het schip maakt het mogelijk om naar voren worden verplaatst, waardoor een groter venster zodra de oogzenuw is bereikt.
- Gebruik een scherpe tang of pincet die hebben hun tips gebogen naar binnen om zorgvuldig te kiezen en de dunne laag van bindweefsel te verwijderen over de extraoculaire spieren en traanklier. Trek de extra oculaire spieren van anterior naar posterior van de baan. Greep het proximale deel van de spier met een pincet en het gebruik van een tweede paar van gebogen gekartelde oog dressing een tang om naar buiten tractie toe te passen op de spier. Zorg ervoor dat het oog dressing pincet georiënteerd zijn in dezelfde richting als de spier bij het trekken om te voorkomen scheuren. Haal de meest anterior van de baan (Superior Oblique) op deze manier. De spier zal bevrijd van diep binnen de baan en de resterende lengte kan worden teruggetrokken om de ogen naar buiten te draaien.
- Herhaal stap 3.8 met de volgende spier (Mediale Rectus), dat is gelegen tussen de lobben van de traanklier en Harderian Gland de buurt van de middellijn van het dorsale oppervlak van het oog. Band naar beneden het oprolmechanisme om tractie te behouden op de spieren.
- Verwijder eventuele resterende bindweefsel over het oppervlak van de traanklier en omhoog tillen van de klier met behulp van pincet. Niet comprimeren of knijp in de klier. Om terug te trekken van de klier, slechts een enkel schip op de achterste paal moet worden verbrand. Til de achterste einde van de klier omhoog, en vervolgens cauterize het schip.
- Volgende naar voren flap de traanklier aan het achterste deel van de baan open en ongehinderde toegang tot de spieren die de oogzenuw liggen boven toe te staan. Houd het gebied constant vochtig met steriele PBS, en drogen met chirurgische watten of wattenstaafjes.
- Met behulp van scherpe tang opnieuw te verwijderen van de dunne bindweefsel dat de spieren van de achterste baan (Levator palpebrae superioris en Superior Rectus) omgeeft en scheiden de onderliggende bundels van de spier. Trek de spieren zelfstandig of in koor, met behulp van de gebogen gekartelde oog dressing pincet, nogmaals, trekken in lijn met de spiervezels. Bevestig de resterende spier lengtes tot het oprolmechanisme, samen met de spieren die zijn ingetrokken in stap 3.8 en 3.9 en band naar beneden het oprolmechanisme tractie toe te passen. Een totaal van vier spieren zal nu worden toegevoegd aan het oprolmechanisme. Dit zal draaien de ogen naar voren en naar buiten om het vet waarin omhulsel dat de oogzenuw omringt te onthullen.
4. Toegang tot de Optic Nerve
- Gebruik scherpe pincet (Fine tip Dumont) om omhoog te trekken op het bindweefsel dat de vettige omhulsel van de optische zenuw omgeeft. Maak een longitudinale gesneden met behulp van kleine Vannas voorjaar schaar. Vouw de cut als dat nodig is. Het vet opgenomen door het omhulsel beginnen te puilen uit zodra de snede wordt gemaakt. Volgende verwijder de flappen van bindweefsel door zorgvuldig te trekken naar boven vanaf de rand en het afsnijden van de halvemaanvormige kleppen van het weefsel.
- Verwijder het vet bedekkende de oogzenuw door gebruik te maken tang te trekken op het vet, terwijl het snijden met de Vannas veer schaar. Houd het gebied schoon met steriele PBS en chirurgische swabs om de kleine hoeveelheden bloed die voortvloeien uit de verwijdering van het weefsel schoon te maken.
- De oogzenuw is nu zichtbaar. Om de zenuw toegang, moet de meningeale schede die de zenuw omgeeft worden verwijderd zonder beschadiging van de oogheelkundige slagader die de binnenste netvlies feeds. Onderzoek van de vasculaire patroon van de meningeale schede met behulp van een tang om voorzichtig te draaien de schede. Zoek naar een gebied zonder bloedvaten, en op grond waarvan een longitudinale snede te worden gemaakt in de meningeale schede.
- Met behulp van fijne punt Dumont tang, knijp de dura en trek naar boven. De buurt van de basis van de driehoekige wig van dura dat wordt gemaakt, gebruikt u de Vannas voorjaar schaar om een kleine incisie in de schede te maken. Steek het onderste blad van de schaar in de incisie en snijd de schede parallel aan de richting van de oogzenuw, Pas op dat u het vaatstelsel schade met laterale bezuinigingen. Gebruik de tang en schaar om de dura draperen aan weerszijden van de oogzenuw.
- De enige overgebleven bekleding van de zenuw is de arachnoidea membraan. Het is zeer dun en transparant. Om te bepalen of het membraan is nog steeds aanwezig zijn, gebruikt scherpe tang aan het oppervlak van de zenuw bekneld raken. Het de arachnoidea aanwezig is, knijp het membraan en trek naar boven om een driehoekige wig van het weefsel te creëren. Maak een kleine incisie met de punt van de schaar gelijk aan 4,4 Step. Vervolgens steekt u de onderste blad van de schaar en maak een longitudinale snede in de arachnoidea. Vervolgens gebruik je schaar en pincet om de arachnoidea draperen aan weerszijden van de oogzenuw.
- Met behulp van een micro-surgische haak, verheffen de optische zenuw uit de meningeale schede. Voorbij het uiteinde van de haak rond de buitenste rand van de zenuw en zorg ervoor dat de haak blijft in contact met de zenuw, zodat u niet de vangst van de meningeale membranen met de haak en per ongeluk transect ze. Til de optische zenuw uit de meningeale schede en volledig transect de zenuw achter de punt wordt ondersteund door de haak. De doorsneden oogzenuw stronk zal nu een vrij uiteinde, zodat voor het verwijderen van de haak.
- Als de RGC gaan retrogradely worden geëtiketteerd om overleven kwantificeren, plaats een klein stukje gelfoam gedrenkt in 3% Fluorogold (of een ander retrograde tracer) over de doorsneden oogzenuw stomp (zie Jove-protocol 2261 ).
5. Afsluiting en herstel
- Ontlast de tractie op de extra oculaire spieren en terug te keren het oog naar een neutrale positie. Terwijl u dit doet, zorg ervoor dat de gelfoam duwen naar beneden in de baan van het oog om ervoor te zorgen dat als het oog is terug op zijn plaats gedraaid, de gelfoam blijft rond de oogzenuw stomp. Breng de traanklier en extra oculaire spieren hun natuurlijke positie.
- Zet de klep van de huid aan de middellijn en de hechting van de wond. Van toepassing zijn oogheelkundige oogzalf aan beide ogen. Schakel dan de isofluraan bron en laat het dier om te ademen zuurstof voor enkele minuten. Plaats het dier in een verwarmde kooi of een kooi onder een warmtelamp om te herstellen. Plaats geen beddengoed in het herstel kooi om de kans op aspireren beddengoed tijdens het herstel te elimineren.
- Dieren dienen onafhankelijk van elkaar worden gehuisvest na de operatie. Postoperatieve analgetica moet worden toegediend volgens de richtlijnen van uw dier zorg autoriteiten, en dieren dienen zorgvuldig gecontroleerd te worden na de operatie.
6. Representatieve resultaten:
Doorsnijding van de oogzenuw resulteert in het verlies van 90% van de gewonden RGC binnen 14 dagen postaxotomy 9-11. Het belangrijkste mechanisme van de RGC dood is apoptose 9, 12. De normale dichtheid van RGC is ongeveer 2500 cellen / mm 2. Epifluorescentie of confocale beeldvorming kan worden gebruikt om het label retrogradely RGC visualiseren na axotomy. RGC apoptose wordt vertraagd met ongeveer 4 dagen na de axotomy, het verlaten van een tijdvenster voor experimentele manipulaties. Op 1 dag na axotomy en retrograde etikettering met Fluorogold, RGC cellichamen in het ganglion cellaag van het netvlies en axon bundels in de zenuwvezellaag van het netvlies zijn duidelijk zichtbaar wanneer imaging een flatmounted voorbereiding (figuur 1a). Van 14 dagen na axotomy, hebben de meerderheid van de RGC stierf, en een paar overgebleven RGC worden afgewisseld tussen het netvlies microglia (afb. 1b). Bij het RGC ondergaan apoptose, microglia fagocyteren de dode cellen en als gevolg daarvan worden transcellularly gelabeld met de fluorescerende tracer die werd gebruikt om het RGC 13, 14 label. Het uiterlijk van de tracer in de fagosomen van microglia verschilt van die in overleven RGC. Microglia bevatten de tracer in zeer geconcentreerd en zeer helder fagosomen die relatief groot en verspreid over hun cytoplasma (afb. 1c). RGC heeft een meer diffuus patroon van vlekken (figuur 1c) met kleine blaasjes die punctata zijn retrogradely zijn vervoerd naar hun axonen het indienen van de cel cytoplasma. Deze blaasjes zijn veel kleiner en hebben minder intense fluorescentie zodat men overgebleven RGC te onderscheiden van microglia. Bovendien, microglia hebben veel kleinere cellichamen en hebben de neiging om een stervormige of amoeboid morfologie in tegenstelling tot RGC dat relatief groot en rond cellichamen te hebben. De dendritische bomen van RGC kan ook helpen onderscheiden ze van de korte felle processen van microglia, toen de kwantificering van overleving van de cel. Overleving van de cel kan worden gekwantificeerd in verschillende regio's van het netvlies en de dichtheid (cellen / mm 2) kan worden afgeleid uit het gebied van de overeenkomstige microfoto, omdat RGC zijn te vinden in een monolaag binnen het ganglion cel laag.
Figuur 1. Epifluorescentie microfoto van Fluorogold gelabeld RGC na axotomy en toepassing van de tracer aan de oogzenuw stomp. (A) 1 dag na axotomy RGC en hun axon bundels zijn voorzien van de tracer in een fijn punctata manier. (B) Uiterlijk 14 dagen na axotomy, hebben 90% van de RGC overleden en helder gelabeld microglia die hebben gefagocyteerd dode cellen zijn ook voorzien van de tracer. (C) Hogere vergroting illustreert het verschil tussen de RGC en microglia (rood pijlpunten) op 14 dagen postaxotomy. Schaalbalk in A en B is 50 micrometer. Schaalbalk in C is 25 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn vele variaties van deze chirurgische procedure en een aantal van de stappen in dit protocol zijn niet nodig. Het is alleen nodig om de spieren die de oogzenuw liggen boven om toegang te krijgen tot de zenuw trekken. Echter, dit resulteert in een zeer beperkte werkruimte rondom de zenuw waardoor de kritieke laatste stadia van doorsnijding moeilijker. In bepaalde situaties is het wenselijk om transfecteren de cellen van de oogzenuw stomp en de toegenomen toegang tot de ruimte geboden door het terugtrekken van alle van de oculaire spieren en de traanklier is gunstig in dit geval.
De meest kritische stappen in het protocol zijn Steps 4.3-4.6. Het is belangrijk dat u de vasculatuur schade rond de oogzenuw hoofd. De zenuw moet worden doorsneden 1,5-2,0 mm van de achterkant van het oog om eventuele schade aan de oogheelkundige slagader die de zenuw penetreert binnen een millimeter van het oog en voedt het bloed naar de binnenste netvlies te voorkomen. Zo kan door het handhaven van een kleine werkafstand van de achterkant van het oog schade aan de oogheelkundige slagader worden vermeden. Het netvlies is meestal transparant en bloedvaten kan duidelijk worden afgebakend. Als de bloedtoevoer netvlies is beschadigd het netvlies zal degenereren leidt tot een melkachtig wit vlokkig uiterlijk. Het glasvocht kamer van het oog en de lens zal typisch wolk over als goed, met het oog krimpende in omvang in de tijd.
Met de praktijk, kan alle stappen in de volledige chirurgische procedure worden bereikt in 10-15 minuten per oog, zodra de eerste entry sneden zijn gemaakt. De procedure kan ook worden uitgevoerd vanaf een laterale benadering van de baan en de beide routes is zeer vatbaar voor procedurele wijzigingen gebaseerd op de voorkeuren van de onderzoeker. Dit model heeft een zeer reproduceerbare tijdsverloop van celdood en er zijn verschillende manieren om de retina globaal doel of tot rechtstreeks te richten gewond RGCs in om de effecten van experimentele behandelingen op overleving van de cel te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
PDK wordt ondersteund door een CIHR exploitatiesubsidie (MOP 86523)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic Frame | Stoelting Co. | ||
| Rat Gas Mask | Stoelting Co. | ||
| Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Isoflurane (PrAErrane) | Baxter Internationl Inc. | DIN 02225875 | |
| Surgical Microscope | WPI, Zeiss, Leica | ||
| Fluorogold -(Hydroxystilbamidine bis(methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| Gelfoam | Pharmacia Corporation (Pfizer) | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | ||
| Proviodine | Medline Industries | MDS093945H | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Fine tip Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Micro surgical hook | Fine Science Tools | 10062-12 | |
| Eye dressing serrated forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #7b sharp curved serrated forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 |
References
- Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).
- Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration. Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).
- Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).
- Weishaupt, J. H., Bahr, M. Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system - molecular death and survival pathways. Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).
- Valenzuela, G. arcia, E, S. C. S. harma Rescue of retinal ganglion cells from axotomy-induced apoptosis through TRK oncogene transfer. Neuroreport. 9, 3165-3170 (1998).
- Kugler, S. Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death. Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).
- Lingor, P. Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo. Brain. 128, 550-558 (2005).
- Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125, 903-920 (2004).
- Berkelaar, M. Axotomy results in delayed death and apoptosis of retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci. 14, 4368-4374 (1994).
- Villegas-Perez, M. P. Influences of peripheral nerve grafts on the survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci. 8, 265-280 (1988).
- Villegas-Perez, M. P. Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats. J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).
- Quigley, H. A. Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36, 774-786 (1995).
- Thanos, S. Specific transcellular carbocyanine-labelling of rat retinal microglia during injury-induced neuronal degeneration. Neurosci Lett. 127, 108-1012 (1991).
- Thanos, S. Specific transcellular staining of microglia in the adult rat after traumatic degeneration of carbocyanine-filled retinal ganglion cells. Exp Eye Res. 55, 101-117 (1992).
